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[Immunologie] Immuno-précipitation/liaison protéineA-Fc

Juste une petite question, Après une IP à l'aide de billes de sepharose couplées à la protéine A, comment déstabiliser les liaisons protéine A-Fc des Ig sans abimer ma protéine d'intérêt.  [...] Plusieurs solutions mais après il faudra optimiser. augmentation de la force ionique (tu incubes par exemple ton complexe dans un tampon assez concentré en NaCl, entre 100 et 500 mM, après il faut optimiser), ajout d'un détergent (triton, CHAPS (assez doux donc risque de ne pas marcher), surtout pas de SDS bien sûr), probablement d'autres solutions sont envisageables.   [...]

[Biochimie] Phasage

Remplacement moléculaire. A l'aide d'une protéine homologue (donc on espère qu'elle a un repliement tridimensionnel similaire), on place cette protéine homologue au même endroit (tenir compte groupe espace, maille, nombres de molécules dans UA) que notre protéine d'interet.  [...] Remplacement isomorphe. On va jouer sur la différence de diffusion entre un cristal de notre protéine seule et un cristal de protéine contenant un atome lourd (riche en électrons car les RX interagissent avec les électrons). Cette atome lourd ne doit pas modifier le cristal (paramètres de maille, groupe espace, repliement de la protéine.  [...]

Phage display et banque d'ADNc

Le principe c'est de faire exprimer la protéine à la surface du bactériophage et puis d'isoler les bactériophages qui expriment la protéine d'intérêt à l'aide d'Ac (et pour réaliser ca, on fait des protéines de fusion).  [...] A la fin, tu te retrouves avec une série de candidats, pour lesquels tu vas exprimer la protéine à plus forte concentration afin de réaliser des tests d'interactions définitifs.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

Ce qu'il faut comprendre est plus simple. Le promoteur est inductible par le méthanol. On isole et on clone ce promoteur, on met la séquence codante que l'on veut derrière. Du coup, on crée une protéine dont l'expression est inductible par le méthanol.  [...] En fait, j'ai compris, ce gène AOX c'est un gène qui lorqu'il est induit il permet l'expression de notre protéine dans un pourcentage de 30à 40 % des protéines totales...le promoteur de ce gène est trés fort... et donc l'astuce est de mettre ce promoteur en amont du géne d'interêt.  [...]

[Biochimie] Activité enzymatique

Je cherche à doser l'activité d'une enzyme impliquer dans l'amylolyse. Je travaille sur des bouilles de farine que je resuspend dans du sérum physiologique. J'ai besoin de centrifuger à 10 000g et je me demande si je ne précipite pas mon enzyme d'intérêt. Comme je n'ai aucune expérience en protéine/enzymo je sollicite votre aide.  [...] Ca me rassure si les protéines ne précipite pas dans du sérum physiologique, c'est déja une très bon point à vrai dire. Par contre il est quasiment impossible de solubiliser le culot et même de le pipetter(c'est de l'amidon bien pateux style maizena en plus compacte) a moins de chauffer fortement, ce qui a mon avis va alterer l'activité enzymatique.  [...]

Probème de smear sur gel d'électrophorèse de protéines

La protéine d'intérêt fusionnée en N-terminal à la GST a été exprimée chez E. coli puis purifiée sur résine cobalt (lavage en batch). La protéine de fusion a été clivée à la thrombine. La protéine d'intérêt est éluée par simple centrifugation. La protéine de fusion toujours accrochée à la résine est éluée avec de l'imidazole.  [...] Sur la poste correspondant à la protéine d'intérêt (piste 7. 16KDa. flèche noire), il y a quelques contaminants mais surtout un smear remontant vers le haut. On ne retrouve pas ce smear dans l'élution de la GST (piste 8. flèche noire).  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique GST-Pull Down

cette technique permet de fusionner la GST avec une protéine d'intérêt pour par exemple étudier les partenaires protéiques,  [...] Pour la séparation de la GST fusionnée à la protéine d'intérêt, c'est peut-être à la digestion à la protéase de pré-scission (PSP (non pas la console ), au facteur Xa ou à la thrombine que tu fais référence.  [...]

[Biochimie] Constante d'affinité

j'ai réalisé il y a peu de temps des cinétiques pour ma protéine d'intérêt et son mutant, j'obtiens un K A de 5.10 5 M -1 pour la protéine sauvage et 2,5. 10 6 M -1 pour la mutante. N'étant pas une experte en biochimie je ne sais pas trop si la différence entre mes 2 protéines est significative. Pouvez-vous m'aider.  [...] Il y a bien quelqu'un ici qui a déjà fait des études de cinétique.   [...]

[Biochimie] Différence western blot / immunoprécipitation

Certes, mais le gros intérêt de la technique est qu'une fois la protéine d'intérêt précipitée, on peut révéler des protéines qui interagissent potentiellement avec elle puisqu'elles auront été entraînées également. Et ça on ne peut le faire en wb.  [...] Du coup cette raison me semble valable et j'y avais pensé, c'est mieux d'avoir la seule protéine sur la membrane plutôt que toutes les autres avec, même si l'anticorps n'est censé révéler que la protéine d'intérêt.  [...]

[Biochimie] Petite question sur le Western Blot

Soit une cellule 1 contenant, je dis n'importe quoi mais peu importe, 100 % de protéine A soit 1 ug de notre proteine A d'interêt.  [...] Quand j'aurai le résulat de mon WB, je me dirais que mon composé testé à diminué la synthèse de ma protéine A d'interêt...alors qu'en fait ce n'est pas le cas, le composé a favorisé la synthèse d'une autre protéine.  [...]