• Forum - ADN, Vecteur, Enzyme, Site, Promoteur

[Biologie Moléculaire] Transcription in-vitro

Je me demandais pourquoi, lors d'une transcription in-vitro, on doit obligatoirement linéariser le vecteur contenant l'ADN d'intérêt. Par exemple j'ai cloné mon ADN dans le vecteur pSFV1 pour le transcrire in-vitro je dois linéariser le vecteur à l'aide de l'enzyme Spe1 dont le site est situé juste avant le promoteur SP6 nécessaire à la transcription.  [...] Puisque mon vecteur c'est de l'ADN double brin, l'ARN polymérase devrait pouvoir se fixer sur le promoteur même si mon vecteur est encore circularisé non.  [...]

[Génétique] Mécanisme de transcription

ensuite le promoteur est une molécule qui permet le début de la transcription en permettant à l'enzyme de se fixer à l'adn et de reconnaitre le site d'initiation, d'où commencera la transcription.  [...] Si on est d'accord sur cette définition, alors on peut effectivement parler d'un promoteur en amont (avant) le site d'initiation de la transcription (symbolisé par la séquence AUG). Le consenscus dans la communauté scientifique quand il est question de l'ADN c'est de parlé de 5'-3'.  [...]

Intégration dans un plasmide

L'intégration de séquence d'intéret ( un ou plusieurs gènes ) se fait par technique d'ADN recombinant. En gros, tu vas utiliser des endonucléases ( ou enzymes de restriction) qui font créer des extrémitées cohésives ( pouvant être ligasé par une ADN ligase ) sur ta séquence d'intérêt et sur ton vecteur plasmidique.  [...] C'est pour cette raison qu'on utilise un vecteur d'ADN circulaire pour introduire un gène dans une bactérie. Ce vecteur est souvent un plasmide modifié (avec de nombreux sites d'intégration possibles, un promoteur fort avant ces sites, des gènes de sélection pour pouvoir distinguer les bactéries qui ont intégré le plasmide...).  [...]

séquence kozak

je souhaite faire une transgénèse chez la drosophile, je dispose d'un vecteur possédant le promoteur qui m'intéresse. De plus, j'ai également l'ADNc d'interet avec les séquence 5' et 3' UTR mais je clone directement à l'ATG. Je vais créer un site de restriction avant cet ATG afin de pouvoir le cloner faut il aussi que j'ajoute une séquence Kozak pour avoir une bonne expression de ma prot ou n'est ce pas nécessaire.  [...]

genes eucaryotes

- Régions flanquantes.Les gènes sont séparés par des séquences d'ADN sans signification connue (introns) qui représentent probablement au moins 90 p. 100 du génome chez l'homme. - Zone de contrôle.Cette zone, située parfois à distance du gène, contrôle sa transcription, induisant une stimulation ou une inhibition de celle-ci, en fonction de messages venant de l'extérieur de la cellule, comme des hormones, ou de l'état de différenciation de la cellule.  [...] - Promoteur.La zone promotrice porte le site de fixation des enzymes permettant la transcription du gène. Elle porte également des sites de fixation pour d'autres protéines, l'ensemble formant le complexe d'initiation de la transcription. - Introns.Les introns sont des segments d'ADN non codants insérés entre les exons (parties codantes).  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

Le vecteur d'expression contient en plus de la séquence de résistance et du site de multi-clonage et du site d'origine, il contient en plus un promoteur.  [...] Une Enzymes de restriction est une endonucléases d'origine bactérienne capables de cliver l'ADN double brin en des sites spécifiques.  [...]

transgénèse végétale

Dois-je prendre des primers qui ont un site de restriction bien spécifique pour pouvoir mettre l'ADN amplifié dans le vecteur ti désarmé après Quel doit être la longueur du primer environ.  [...] Le promoteur 35S faut-il que je le clone aussi dans le vecteur ou est il généralement déjà dans les plasmide ti désarmé avec un site polylinker Si quelqu'un connait un site ou il y a un schéma ce serait super.  [...]

[Biologie Moléculaire] transcription ADN en ARN

pour la réplication, chacun des brins se voient répliqués, et l'élongation se fait par formation d'une nouvelle double hélice (élongation avec formation de liaisons hydrogènes) mais la pour la transcription, un des 2 brins est répliqué (transcrit), et l'ARNm est monocatenaire, donc je n'arrive pas avoir comment se fait l'incorporation et l'élongation par rapport au brin matrice (il y'a des shémas qui ressemblent a l'élongation du polypeptide sur le ribosome), mais, il se balade tout seul (je ne fais pas le lien entre la matrice et l'ARNm qui se balade tout seul, alors que dans la réplication et la réparation du DNA, je voyais bien l'élongation.   [...] La première étape est l'initiation de la transcription, l'enzyme reconnaît et se fixe sur le promoteur du gène (région située en amont de la séquence à transcrire). Il y a ensuite fusion de l'ADN (séparation des deux brins, formation d'une bulle ). Parmi les deux brins d'ADN, un seul servira de matrice à l'enzyme pour la synthèse de l'ARN.  [...]

[Biotechnologie] Fabrication d'une protéine d'intérêt ?

Il manque une étape entre la production du cDNA et la transfection dans les cellules. Le cDNA est inséré dans un vecteur d'expression qui contient outre les éléments classiques d'un vecteur (Ori, MCS, marqueur de sélection) un promoteur de transcription ainsi qu'un RBS (ribosome binding site) qui va permettre la traduction du transcrit.  [...] Un vecteur d'expression est un plasmide (un morceau d'ADN spécifique des bactéries) circulaire qui a été trafiqué dans sa séquence pour être utilisé pour exprimer des protéines. En gros, on utilise habituellement des enzymes de restriction pour couper l'ADN et introduire de l'ADN, ce plasmide en contient beaucoup, positionner après un site qui induira la trancription du fragment ajouté en ARN.  [...]

[Biochimie] formulation inconnue

A-type cyclins contain destruction box (D-box) sequences, which have been reported to mediate protein degradation (Glotzer et al., 1991). To express the CYCA2.3-GFP fusion protein at even higher levels, we changed its D-box sequence to a nonfunctional one (from RAVLGEITN to GAVVGEITN.   [...] Les CDK portent l'activité kinase, les cyclines portent le domaine de liaison au substrat (binding domain), l'association des deux permet la formation d'une kinase fonctionnelle. En faisant une recherche sur un site de bioinformatique comme prodom ou autres (je ne les ai pas tous en tête, mais une recherche à partir d'Expasy devrait te donner de bonnes pistes) te permettra de connaitre les noms des différents domaines de cette cycline.  [...]