• Santé - Western, Protéine, Intérêt

[Biologie Cellulaire] mise en évidence d'une phosphorylation

Ensuite, si l'une des kinases (ou les deux) phosphoryle votre protéine, cela veut dire qu'elle interagissent physiquement entre elles. Dans ce cas, cela peut être mis en évidence par co-immunoprécipitation. immunoprécipitation anti-kinase, western blot anti-protéine d'intérêt.  [...] immunoprécipitation anti-protéine d'intérêt, western blot anti-kinase. Pour approfondir la spécificité de phosphorylation de votre protéine, vous pouvez faire de la mutagenèse dirigée sur la séquence consensus (par sur la sérine ou thréonine potentiellement phosphorylée par contre), qui devrait empêcher sa reconnaissance par la kinase.  [...]

[Biochimie] Protéine non détéctable

Voila, j'ai réalisée une construction dans le pCS2 flag, la construction a été vérifiée par séquencage sans aucun soucis. Par contre pas moyen d'avoir la protéine en western blot, j'ai donc réalisé une autre construction qui exprime ma protéine d'intérêt fusionnée à la GFP même chose rien.  [...] Si vous voyez la GFP vous pourrez faire une ICC pour aller faire votre WB@FLAG pour vous assurer que votre protéine est bien produite. Dans ce cas là, c'est un problème biologique. La protéine que vous injectez dans vos oeufs doit elle se trouver là en temps normal.  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

j'aimerais savoir si quelqu'un à l'habitude de réaliser des immunoprécipitations avec révélation de la protéine d'intérêt en western blot.  [...] mon éluat final d'IP contient l'Ac que j'ai utilisé pour réaliser mon IP et bien sur ma protéine d'intérêt, je réalise ensuite un SDSpage et un western sur la nuit, je révèle mon blot à l'aide de l'Ac que j'ai utilisé pour mon IP ainsi qu'avec un Ac-HRP dirigé contre mon Ac d'IP, je bloque la membrane avec lait écrémé 3%.  [...]

besoin d'aide pour technique direct blot and following immonoprecipitation

Le but est de rechercher une forme tronquée d'une protéine. le texte est en anglais et dit que la technique utilisé est. direct blot and following IP. Je préfère le mettre en anglais car je ne sais pas trop comment le traduire et je pense que c'est plus clair comme ça.  [...] Je pense qu'ils font d'abord une immunoprécipitation de la protéine d'intérêt puis un western blot pour séparer la forme sauvage d'une éventuelle forme tronquée. l'expression employée me fais plutôt penser que le marquage (blot) est fait en premier et l'IP ensuite.  [...]

Anticorps anti Lipocalin2

Je fais un western sur des echantillons de fois de souris. La Lipocalin2 est ma proteine d'interet. J'ai un anticorps de chez Thermo, mais il ne marche pas. Quelqu'un aurait-il des réferences d'un AC qui marcherait bien chez la souris.  [...] je ne connais pas la lipocalin2. mais je peux vous donner des références de boîtes qui font de très bons anticorps en général.   [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction protéines pariétales

Dans le but de faire un western-blot avec un anticorps (polyclonal) je me lance dans des extractions de protéines. Seulement (pas de bol) ma protéine d'intéret est ancrée dans le peptidoglycane de ma bestiole de façon covalente (motif LPXTG). Pour info je bosse sur une bactérie G+ qui a la mauvaise idée de résister au lysozyme.  [...] Sinon euh... je sais que moi j'extrait mes protéines par variation du pH en connaissant le pHi de mes molécules d'intéret (ph9 en récupérant le surnageant puis précipitation à pH 4,5 mais je ne sais pas si ça pourrait t'être utile).  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de la trypsine pour un test de repliement des protéines

Je viens de découvrir une nouvelle méthode qui consiste à traiter des extraits cytoplasmique avec de la trypsine (1, 3, 10...µg/ml) pendant 5 min, faire un western blot avec un anticorps pour la (les) protéine(s) d'intérêt et regarder si les bandes observées sont à hauteur attendue (bonne taille en KDa), ou avec des tailles inférieures ou si elles ont complétement disparu.  [...] Si les protéines sont résistantes à un traitement à la trypsine à forte concentration c'est qu'elles sont bien repliées et donc moins accessibles à cette protéase.  [...]

[Biochimie] Expression protéique

Je réalise un clonage hétérologue d'une protéine (VapA).Le gène codant ma protéine d'intéret est exprimé (étude ARN ok) mais le problème est qu'elle est indedectable que ce soit au sein de la bactérie (Mycobacterium marinum) ou du surnageant en Western blot.  [...] La protéine est détectée par Western blot et le contrôle positif est correcte. A quel niveau sont sensé agir les régions régulatrices Lors de la traduction N'est ce pas un peu tard une fois que les ARNs sont synthétisés.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot

Je connais le Western Blot (tout court) qui permet de detecter une proteine d'interet avec un anti corps mais est ce que vous pourriez m'éclairer sur les autres.  [...] Ca ne serait pas plutot une électrophorèse bi-dimensionnelle C'est à dire une isoelectrofocalisation + SDS-PAGE pour une protéine.  [...]

[Biochimie] élution protéine

Soit tu fais un western blot avec un anticorps dirigé contre ta protéine d'intérêt. Cela ne te permettra pas de tirer une conclusion définitive mais d'avoir une idée sur la nature des pics. Pour avoir une conclusion quasi-définitive, tu analyses tes échantillons par spectrométrie de masse (ESI-MS douce pour une indication de masse, MS-MS pour une définition de la séquence peptidique).  [...] - Le pic contaminant est celui qui sort le plus tard. perte de protéines habituellement associées à ta protéine (peu probable), perte de la structure quaternaire de la protéine (tout ce qui concerne l'association et l'organisation en multimères) qui ne provoque pas de perte d'activité enzymatique.  [...]