• Santé - Western, Méthode, Transfert

[Immunologie] immunoblote

C'est comme un western blot sauf que la méthode de transfert est différente.  [...] Pour le western c'est un transfert électrique des protéines alors que l'immunoblot c'est un transfert qui se fait sous vide de pression.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Il n'y a pas de tampon de transfert étant donné que c'est un transfert à sec. Une fois que ton gel a migré, tu utilises un appareil spécial pour cela et en quelques minutes, c'est transféré. Ca revient un peu plus cher que la méthode classique (7 à 8 euros par transfert de mémoire) mais pour les grosses protéines ça marche largement mieux.  [...] Ces dernières semaines j'ai essayé plusieurs méthodes de transfert d'après les conseils du service technique de BioRad, mais sans succès. Ils sont prêts à nous prêter l'appareil de transfert à sec. Vu que ceci est mon dernier recours, je n'aimerais pas le rater.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Bonjour, c'est encore moi, et j'ai toujours pas réussi à optimiser mon western blot, j'ai tout tenté, même de changer d'appareil pour le transfert sur membrane.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Juste pour en remettre une couche moi aussi, il existe des tampons de transfert SANS methanol... c'est vachement mieux pour l'environnement ainsi que pour sa propre sante, et ca ca marche aussi bien. En plus, il suffit de peser la poudre et de la diluer, et le tour est joue.  [...] Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

C'est une question interéssante et j'avoue que je ne suis pas sûre de moi mais je n'avais pas la même idée que toi, pour moi la différence ne réside pas dans une expression stable ou prolongée. Pour moi, la transfection c'est utiliser des méthodes chimiques ou physiques pour introduire ton plasmide, comme des liposomes, ce qui n'empêche pas de distinguer une transfection stable et transitoire.  [...] Je suis d'accord avec Delphinette. Après, la méthode à utiliser dépend de ce que tu veux faire. Si c'est pour une expression transitoire, il est beaucoup plus simple d'utiliser un liposome, car même avec un taux de transfection très faible, tu peux voir ta protéine exogène facilement en western-blot.  [...]

[Biologie Moléculaire] Biochimie: méthode de Western Blot

Quand je fait une recherche sur internet à propos de la méthode de Western Blot qui sert à identifier et détecter des protéines je trouve qu'il faut réaliser un dosage avec la méthode de Biuret avant la manipulation. Je ne comprend pas pourquoi réaliser ce dosage vu qu'il sert seulement à connaitre la concentration en protéine d'une solution.  [...] Cependant, si c'est juste pour s'assurer de la présence (ou l'absence) d'une protéine, il n'y a théoriquement pas besoin de cette étape (même si c'est plus rigoureux de la faire).   [...]

[Biochimie] fonctionnement d'un stacking gel

J'ai bien compris à quoi sert le gel de stacking ( à ce que l'échantillon soit concentré sur une bande très fine avant d'entrer dans le gel de séparation ), mais par contre, je n'ai pas du tout compris son fonctionnement.   [...] Une bonne source en ce qui concerne l'explication de la méthode complexe du western blot. http.//www.cours-de-biochimie.fr/western.php.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Pour le moment j'essaie de transférer 20 ug de protéines par puits, les transferts sont faits à 100V à 4°C avec un agitateur dans la cuve, le temps de transfert allant de 1h à 2h45 (avec un meilleur transfert dans le dernier cas mais il doit encore rester 30 à 40% des protéines dans le gel).  [...] Au début j'utilisais un tampon de transfert contenant 20% de Méthanol avec 25 mM de Tris Base et 190 mM de Glycine. J'ai entre temps diminuer la concentration de Méthanol à 10% et j'ai donc observé un meilleur transfert. J'ai aussi essayé avec des gel de 0.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ampérage d'un transfert western blot

Voilà deux semaines que je réalise des transferts sur membrane PVDF de gel 2D. Le transfert se déroule sur toute la nuit à 4°C à voltage constant (30V).  [...] Ma question est donc simple. pourquoi cette augmentation de la résistance Le tampon de transfert aurait-il changé durant la nuit Se serait-il chargé en sels.  [...]

[Biochimie] Western blot

Cependant une personne de mon équipe a réalisé un transfert d'une très grosse protéine (. 300 kDa) et il a un tampon de transfert adapté, pris d'une publie. Il réalise son transfert à 20V à 4°C et a noté une nette amélioration du transfert des marqueurs de haut poids moléculaire comparé aux méthodes classiques.  [...] très intéressante cette discussion. Effectivement, est-ce qu'il serait possible d'avoir la référence de la publication sur l'utilisation du tampon de transfert pour les grosses protéines.  [...]