• Santé - Western, Extrait, Protéines, Contrôle

[Biologie Cellulaire] Controle pour Western blot

Je souhaite faire un western blot sur un extrait de protéines nucléaires mais je ne trouve pas de protéine à utiliser comme controle. Auriez-vous une idée de la protéine généralement utilisées pour cela.  [...] histone H3 me semble pas mal (sauf si vous testez des cellules avec justement l'insertion d'isoformes spécifiques des histones. par exemple et principalement le testicule).   [...]

[Biologie Moléculaire] Régulation de NFAT5

Donc l'idée est de faire une immunoprécipitation des protéines ubiquitinilées. Puis un western anti ubiquitine permet de voir l'ensemble des protéines précipitées. Ensuite, sur le même extrait on fait un western anti NFAT5 afin de savoir si il fait partie des protéines précipitées.  [...] La panneau input correspond à l'extrait protéique qui ne c'est pas fixé sur les billes (non immunoprécipité). C'est un contrôle qui permet de s'assurer que les protéines sont quand même présentes dans l'extrait au départ. Si on ne le fait pas on est jamais certain que NFAT5 est présent dans l'extrait initial et du coup un résultat négatif pourrait simplement correspondre à une absence de protéine.  [...]

western

je souhaite savoir quel controle est habituellement utilisé lorsque l on souhaite effectuer un western sur des proteines nucleaires.  [...] J'ai pour cela augmenté la concentration de mon gel de separation (jusque 15% ce qui correspond à une protéine de 28Kd). Cependant certaines bandes non spécifiques restent trop larges (en hauteur) et empechent une bonne visualisation de ma bande d'interet.  [...]

[Biochimie] analyse résultat d'IP

Je ne comprends pas dans les figures B et C (respectivement immunoprécipitation et pulldown) à quoi correspond les colonnes 1/10 input Dilution au 1/10e mais de quoi Pourquoi les bandes sont plus épaisses.   [...] Input, c'est le western effectué sur l'extrait avant IP. Il contient donc toutes les protéines et sert a vérifier que dans ton extrait, la protéine dont tu étudies l'interaction avec ta cible de précipitation est bien présente.  [...]

[Biochimie] Extraction d'un extrain protéique embryonnaire

2. Ma deuxième question concerne la conservation des protéines, je ne sais pas si je dois les garder dans un tampon (buffer) ou si mon extrait de protéine resterait stable à 4°C dans l'eau. Je ne sais pas non plus si le plus simple est de hyophiliser l'extrait et de le garder en poudre.  [...] Est-ce que en poudre on ne dénature pas complètement les protéines Ce n'est pas pour faire un Western ou autre, je veux juste isoler les proténes, qu'elles soit fonctionnels ou non, simplement avoir un extrait de protéines embryonnaires.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

Comparer un gel au bleu de Coomacie avec un western me parait être une bonne idée mais est-on sur que dans l'extrait protéique il n'y aura que la protéine que l'on veut étudier Si on utilise un anticorps contre notre protéine d'intérêt on ne verra qu'elle mais cela ne veux pas dire qu'il n'y a pas d'autres protéines que l'on ne voit pas.  [...] Si tu travailles à partir d'un extrait protéique brut, ton gel coomassie contiendra beaucoups de bande mais dans le cas d'une surexpression de ta protéine d interet, la bande proiminante devrait migrer comme celle de ton WB.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western blot + extraction proteine

Alors voila, je cultive des fibroblastes cutanés en flask de 75cm2 sur lequel j'aimerais faire une extraction de proteines totales pour ensuite faire un WB pour pouvoir detecter ma prot d'intêret.  [...] Oui le dosage dans le Laemli n'est pas possible en effet, mais il n'est pas forcément necessaire de doser les protéines. L'expérience du manipulateur ainsi qu'un contrôle adapté en western permettent d'obtenir un résultat impeccable (je ne fais que des western et j'ai arrêté de doser mes protéines assez rapidement).  [...]

[Immunologie] Production proteine recombinante et anticorps

Tu peux tenter de fabriquer ta propre protéine recombinante si tu as le matériel et des connaisances en clonage (étape préliminaire). Je l'ai fait moi même car ma protéine n'était produite nulpart. (d'ailleurs une société. G... a voulu récupéré le protocole).  [...] Sinon, les sociétés qui commercialisent des anticorps fournissent aussi des protéines recombinantes (ça sert de contrôle en western blot par exemple). Je te garantis pas la qualité. j'ai déjà acheté un anticorps qui ne reconnaissait même pas la protéine recombinante fournie pas la même société.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Est-il possible de casser ces aggrégats sans casser ma protéine Car ayant déjà fait l'expérience, il est impossibe d'avoir un bon signal en western blot avec cette protéine aggrégée.  [...] En effet, la chaleur induit fréquemment la formation d'aggrégats pour les protéines surexprimées. Je pensais que ces aggrégats étaient visibles dans ton extrait cellulaire mais d'après ce que tu me dis tu les retrouves plutôt sur ton western donc ce n'est pas l'ADN.  [...]

Extraction protéique dans du laemmli.

je voudrais faire une extraction protéique directement dans du laemmli, j'ai déjà essayé une première fois, et le ponceau de ma membrane (je veux faire un western) était particulièrement moche, l'extrait avait l'air dégradé.  [...] Je veux faire des extraits de plantules d'arabidopsis, et j'avais fait comme avec mon tampon d'extraction classique, cad, broyage dans le laemmli au piston (dans la glace, je me doute que c'est pas très bon pour le SDS qui est dans le laemmli), suivi d'une centri à 4°C et avant dépôt sur gel, 95°C 5min.  [...]