• Santé - Western, Extraction, Protéine

[Biochimie] extraction protéines, WB elastine murine

[Biochimie] extraction protéines, WB elastine murine.  [...] Je souhaite réaliser un Western-Blot afin de détecter l'élastine de souris. Sachant que l'élastine est une protéine insoluble, je recherche un protocole d'extraction de protéines à partir de tissus pulmonaires de souris qui me permettrait d'obtenir un maximum d'élastine soluble afin de faciliter sa détection par Western-Blot. Je vous remercie par avance de vos conseils.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western blot + extraction proteine

Alors voila, je cultive des fibroblastes cutanés en flask de 75cm2 sur lequel j'aimerais faire une extraction de proteines totales pour ensuite faire un WB pour pouvoir detecter ma prot d'intêret.  [...] Attention attention, le RIPA est un buffer principallement utilisé pour faire des IP. Si ce sont les protéines totales qui vous intéressent ce n'est pas une extraction en tant que telle qu'il faut faire, il vaut mieux lyser classiquement vos cellules dans du Laemli 1X avec béta-mercapto ou DTT.  [...]

[Biochimie] qualité protéines

Je réalise des tests de vieillissements tissulaires et regarde la dégradation au niveau ARN et Protéines.  [...] En ce qui concerne les Protéines, après extraction sur une même masse de tissus je ne vois pas de différence au niveau quantité (je m'y attendais) ni au niveau visuel (gel coloré au bleu de Comassie / bandes majoritaires). Il existe-t-il une protéine témoin de qualité à mettre en évidence en Western.  [...]

Extraction protéique dans du laemmli.

je voudrais faire une extraction protéique directement dans du laemmli, j'ai déjà essayé une première fois, et le ponceau de ma membrane (je veux faire un western) était particulièrement moche, l'extrait avait l'air dégradé.  [...] Sinon je sais qu'il existe un tampon d'extraction tout près chez BIORAD qui permet de faire cette extraction puis de déposer directement sur gel.  [...]

[Biochimie] Différence western blot / immunoprécipitation

Ce sont deux techniques qui n'ont absolument rien à voir. Le Western Blot consiste à révéler la présence d'une protéine sur une membrane grâce à des anticorp, tandis que l'immunoprécipitation consiste à isoler une protéine -éventuellement en complex avec d'autres protéines/RNA/ADN - à partir d'un lysat.  [...] Certes, on réalise parfois un Western Blot après une IP, mais ça n'est pas le corps de l'expérience. On peut faire plein d'autres choses après une IP. récupérer l'ARN lié par la protéine - on parle alors de RNA ImmunoPrécipitation ou l'ADN - et on parle alors de Chromatin ImmunoPrecipitation. par exemple.  [...]

[Immunologie] immunoprécipitation

L'immunoprécipitation est une technique biochimique permettant de mettre en évidence une intéraction physique entre 2 protéines. On effectue d'abord une IP avec une résine permettant de purifier uniquement une protéine et ensuite on révèle par western la seconde protéine qui, si elle est présente, démontre bien que les 2 protéines étaient liées car l'IP ne sélectionne que la première protéine ou la première protéine plus celles qui sont liées à elles de manière covalente.  [...] Si tu a apparition d'une bande sur ton Western avec l'anticorps anti 2eme protéine c'est qu'elle est présente en meme temps que protéine 1, si pas de bande c'est que non.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western sur protéine membranaire

Je cherche a effectuer un western sur un extrait de protéine de levure (donc difficile a casser). cette protéine a la particularité d'etre accrochée et retenue a la membrane vacuolaire (ainsi qu'au RE).  [...] Je fais tous mes western sur une protéine membranaire (mais de cellules humaines et pas de levure) en Laemli (je n'ai jamais su l'écrire) ou d'autres tampons style Guanidium, urée, RIPA,... Ca ne marche pas le Laemli chez la levure Est ce que tu as essayé de casser au dounce.  [...]

[Biochimie] gros loading de protéine pour un western blot

Je fais pas mal de Western blot et mon prof est convaincu qu'il faut des loadings de 60ug de protéine pour avoir une chance de marquer les quelques protéines (Hif1a, VHL...) qu'ont veut (avec des anticorps pour lesquels nous n'avons toujours pas de ctrl positif, soi-dit en passant).  [...] 60µg c'est vraiment beaucoup. L'expérience montre que si l'on charge trop un gel la migration est pourrie et la détection marche mal. C'est ainsi que parfois, quand on y arrive pas il vaut même mieux diminuer la quantité de protéines chargées plutôt que de l'augmenter.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

Dans le but de mettre en évidence des différences dans l'expression de la Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (une protéine de réparation de l'ADN) chez des cellules soumises à différentes concentrations de drogue X, j'effectue des Western Blots.  [...] Suite à quelques problèmes (impossible de mettre en évidence ladite protéine), j'ai décidé d'inclure une étape de sonication pour découper l'ADN des échantillons cellulaires.  [...]

[Biochimie] Interaction cellule-protéine après précipitation (Western Blot)

Me disant que finalement mon problème serait un western moche avec un trop plein de matériel je fais comme si de rien n'était et continue.  [...] Je me demande donc si éventuellement le fait d'avoir précipité le matériel cellulaire ainsi que les protéines provoque certaine interaction ou quelque chose du genre.  [...]