• Santé - Western, Cellules, Protéine

[Biologie Cellulaire] ultracentrifugation et cellules!

je voudrais réaliser des ultracentrifugations différentielles afin de déterminer la localisation d'une protéine spécifique qui m'intéresse. mais au lieu de le faire sur tissu, j'aimerais le faire à partir de culture de HEK. Auriez vous une idée du nombre de cellules dont j'ai besoin pour avoir au final une quantité de proteine suffisante pour faire des western.  [...] Tout dépend du compartiment cellulaire que tu veux isoler, de la représentation de ta protéine dans ce compartiment...Donc c'est par l'expérience que tu sauras quelle quantité de cellule te permet d'avoir une bande convenable en western. Pour commencer tu peux essayer plusieurs conditions où tu auras mis un nombre croissant de cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

donc l'objectif du travail est d'étudier des protéines qui interviennent dans la réparation des cassures double brin de l'ADN.  [...] sachant que l'objectif du travail est de transfécter des cellules eucaryotes par un vecteur d'expression pour étudier les fonction d'une protéine par western et immunofluorescence.  [...]

[Biologie Cellulaire] centrifugation différentielle, peroxisomes

Parce que j'ai fait un Tp où on doit repérer une proteine par immunofluorescence, sur les photos tirées du microscope à fluorescence non confocal, la proteine serait plutôt dans le cytoplasme, peut-être sous forme de vésicules parce que c'est pas très homogène.  [...] On casse les cellules et on fait des centrifugation différentielles, celle à 2000G sépare le culot C1 du surnageant S1. Par analyse avec le Western Blot, avec les Anti-corps dirigés contre ma proteine, on voit que la proteine recherchée est dans la fraction C1.  [...]

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN

Recherche de références d'un anticorps anti FAS HUMAIN.   [...] Je dois faire un western blot de la protéine FAS à partir d'échantillons provenant des cellules HepG2. Quelqu'un aurait-il des références d'anticorps qui marchent bien.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...), la protéine recombinante.  [...] Alors effectivement sur mon western j'ai fait migrer un extrait membranaire de rein et en parallèle un extrait membranaire d'une lignée cellulaire exprimant de façon endogène ma protéine. Les bandes surnuméraires que j'observe dans la lignée sont également présentes dans le rein. C'est effectivement peut être du non spé.  [...]

[Biochimie] qPCR :

Après toutes ces précisions, il est vraiment étonnant que tu n'arrives pas à amplifier l'ARN si le gène est bien exprimé dans les cellules. Les amorces sont bien, et tu as essayé à peu près toutes les astuces connues pour optimiser une PCR ^^.  [...] Si tu as accès à ce type de matériel, il pourrait être intéressant d'essayer un western blot sur tes cellules (détection de la protéine) ou un northern blot (détection des ARN).  [...]

[Génétique] Production d'interleukine 2

J'ajouterais qu'une production en cellule procaryote me parait-être peu intéressante. cette protéine est glycosylée à différents niveaus, et d'après une brève recherche sur google cela a une forte incidence sur son activité biologique. De plus, je ne suis pas pour la production de protéine de cette taille en cellules procaryotes (problème de production en corps d'inclusions...).  [...] L'Il2 étant sécréter, cela va te simplifier la vie... Après ta sélection, tu peux prendre ton surnageant de culture, le concentré un peu (centricon) et réaliser une analyse par électrophorèse SDS PAGE ou encore mieux en western blot afin de valider que tes cellules produisent ta protéine.  [...]

influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

Oui, j'ai fait une analyse par Western Blot (2 anticorps, révélation électroluminescente). Je ne retrouve rien dans le surnageant, mais je retrouve la protéine dans la fraction soluble et non soluble après la lyse des cellules.  [...] 2 mg/ml, ça me semble déjà pas mal en cellules de mammifères. Peut-etre que tu as une proteine naturellement difficile à replier (protéine de plus de 40 à 50 kDa, beaucoup de ponts disulfures, peu de structures secondaires,... ) et que quelque soit le peptide signal que tu rajoutes, tu arriveras à une expression assez faible de toute façon.  [...]

[Biochimie] western surnageant culture

je souhaiterais avoir des renseignements afin de détecter par western blot une protéine contenue dans le milieu de culture de cellules. Faut-il concentrer (précipitation, ultracentri, chromato,...) les protéines présentes dans le surnageant de la culture Comment procéder.  [...] Sinon sur ce forum, Gorben parle souvent d'une précipitation au TCA qui permet de concentrer les protéines. Ca devrait aussi pouvoir vous intéresser.  [...]

[Biologie Cellulaire] mise en évidence d'une phosphorylation

Déjà, afin d'être sûre que la PKA ou la PKC phosphoryle la protéine in cellulo, vous pouvez transfecter des siRNA spécifiques de la PKA ou de la PKC et regarder si le marquage phosphosérine/phosphothréonine diminue voire n'apparait plus en western blot. La manip inverse peut aussi être une validation supplémentaire c'est à dire transfecter un plasmide surexprimant la PKA ou la PKC et regarder en western blot si le marquage par l'anticorps anti-phosphosérine/thréonine augmente.  [...] Après mutagenèse, vous transfectez la construction mutante dans les cellules, elle agira comme dominant négatif de cette phosphorylation sur la protéine endogène et normalement en western blot anti-phosphosérine/thréonine vous aurez une diminution ou abolition du signal.  [...]