• Santé - Vecteur, Sites, Restrictions

[Biologie Moléculaire] Problème de culture de bactéries

Essaie un autre vecteur pour le clonage peut-être, avec le vecteur TOPO plutôt que pGEmt-easy. Ou bien en amplifiant avec des amorces ayant des sites de restrictions puis clonage dans un vecteur adapté à ce que tu veux faire de tes inserts.  [...] Oui on va tenter un autre vecteur.Sinon j'avez pensé a tenter une précipitation de la PCR avec de l'ethanol 70% et des cristaux pour ensuite relancer de façon classique la tranfo.Merci c vos idées en tout cas je vous tient au courant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Numérotation des sites de restriction

Je n'ai pas compris votre réponse. Je vais essayer d'expliciter ma question. En fait j'ai un plasmide psp72 et un insert pst1 et entre le promoteur sp6 et le site de restriction pst1(l'insert) il y'a un écart ce qui est normal. Mais le site de restriction pst 1 porte le numéro 32 et je n'ai pas compris comment le prof a trouvé ça.  [...] On parle d'insertion directionnelle dans un vecteur quand l'on maîtrise le sens de son insertion dans le vecteur, par exemple parce que l'on a choisit de procéder par clonage avec 2 sites de restrictions incompatibles ( chaque extrémité de l'insert se ligera à la seule extrémité compatible du vecteur).  [...]

[Biologie Moléculaire] aide sur le séquençage de l'ADN

Tu peux le cloner dans un vecteur à bouts francs tels que le pGemT-Easy puis envoyer à séquencer l'ADN plasmidique de quelques clones recombinants (vérifiés par PCR) accompagné d'une préparation d'un oligo qui s'hybride sur le vecteur. Le tout selon les conditions requises par le prestataire de services.  [...] Pas nécessairement si vous avez déjà un vecteur ayant des sites uniques de restrictions compatibles avec ceux éventuellement présents au bout de vos amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

Par exemple, tu veux faire un cloner une séquence que tu vas amplifier par PCR avec des sites de restrictions dans les primers pour l'insérer dans le vecteur cible.  [...] - Deuxièmement, lui demande de construire ton plasmide. Tu lui donnes ta PCR avec les deux sites de restriction, et de l'autre ton plasmide cible avec tes deux sites. Et tu récupère la séquence totale de ton nouveau plasmide. Je ne m'embette plus à faire ça sur papier et à vérifier 20 fois si j'ai fais une erreur de phase ou autre en tapant mes séquences vu que tout est déja sur le mac.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sites de restrictions proches sur vecteur

Je voulais donc savoir si BamHI peut cliver son site de restriction lorsque celui ci se trouve trop à l'extrémité d'un fragment d'ADN Je précise aussi que les 6 bases de la séquence palindromique de BamHI sont bien présentes après clivage par XhoI.  [...] Les enzymes de restrictions sont des endonucléases. Il faut donc nécessairement au moins une base avant le site de restriction. En principe c'est quand même bien d'avoir 5 ou 6 bases pour que l'enzyme puisse bien s'orienter sur le site de restriction. Cela dit le tableau de IngDr donne que la restriction est faisable dans tes conditions. Essaie.  [...]

[bio mol] pUC et LacZ

Polylinker= MCS= Multiplie Cloning Site= Région d'un vecteur contenant un nombre plus important de sites de restrictions.  [...] - si ton insert se trouve dans un fragment d'ADN bordé de sites reconnus par les mêmes enzymes, tu vas pouvoir isoler ce fragment de ton ADN de départ (par restriction) et le coller (ligaturer) dans ton vecteur.  [...]

[Biochimie] Gfp

Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer comment on utilise la GFP pour marquer une proteine que l'on veut localiser Peut on marquer la proteine directement ou est on obligé de faire une fusion entre le cDNA et la GFP.   [...] Il existe plusieurs plasmides qui contiennent déjà la séquence codante pour la GFP en phase avec des sites de restrictions permettant de cloner le cDNA. En gros, ça ne change rien par rapport au clonage dans un vecteur d'expression basique en terme de manip'.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ajout de sites de restrictions

Ce qu'il faut faire c'est simplement prendre votre ORF et l'amplifier par PCR en ajoutant aux amorces les sites de restrictions+ 6 nucléotides aléatoires.  [...] En ce qui concerne pGEMT, il s'agit d'un vecteur pensé pour y cloner directement des produits PCR sans digestion de restriction ni ajout de sites.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Pour introduire des amorces avec des sites de restriction en phase il faut rajouter deux nucléotides avant le site BamHI et deux nucléotides après le site de SalI ça sera comme suit.  [...]