• Santé - Vecteur, Résultats, Enzyme

[Biochimie] Question théorique sur clonage TOPO

L'énergie libérée lors de cette réaction permet la formation d'une liaison covalente entre l'extrémité 3' du brin coupé et le résidu tyrosyl-274 de l'enzyme. Cette liaison est ensuite attaquée par l'extrémité 5' hydroxyl du brin d'ADN à insérer dans le vecteur, ce qui a pour résultats de libérer la topoisomérase I et de lier l'insert au vecteur (Figure12).  [...] Je ne comprends pas comment on peut avoir une extrémité 5'hydroxyl j'ai lu sur internet que le produit PCR ne possédait pas d'extrémité 5'phosphate, est-ce pour cela Et si c'est le cas comment cela est-il arrivé je suis sûre qu'il s'agit d'une extrémité 5'hydroxyl car cela est écrit dans le manuel d'utilisation du plasmide (PCR4 blunt topo vector).   [...]

Si on n'inactive pas la phosphatase...?

J'ai une petite question SVP, quand j'ai fait une déphosphorylation d'un vecteur plasmidique j'ai oublié à la fin d'inactiver la phosphatase et juste après j'ai effectué une ligation alors vais-je avoir un problème dans mes résultats à cause de l'inactivation de l'enzyme.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

Si on utilise la même enzyme de restriction pour le vecteur et l'insert, on aura le site de restriction du vecteur qui va correspondre aux extrèmités débordantes de l'insert, donc celui-ci pourra s'hybrider facilement avec le vecteur.  [...] Mes professeurs appelaient ça digestion ménagée. Je crois qu'on utilise un chélateur d'ions divalents pour limiter l'action des enzymes de restriction ( EDTA dans le cas des endonucléases, qui va chélater le Mg2+ dont ces enzymes ont besoin pour fonctionner).  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Je commence mon 1 er clonage, donc pour faire court j'ai coupé mon vecteur avec une enzyme de restriction ApaI, qui devrait le linéariser.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

Vecteur de clonage, PCR et vecteur d'expression

Voilà, peux t-on faire une PCR sur un vecteur de clonage comportant le gène d'intérêt c'est pour le clonage d'une enzyme. Ils parlent de strands (anglais) de plasmides qui ont été amplifiés par PCR dans un premier temps mais je ne sais pas si c'est possible directement sur un vecteur de clonage Le gène d'intérêt est lié au gène GST (gluthation transférase).  [...] Grace a la PCR ils n'ont pas besoin d'enzyme de restriction pour sortir le gene d'interet du plasmide donneur. La seule etape ou elles sont necessaires c'est pour ouvrir le vecteur receveur.  [...]

[Biologie Cellulaire] Séquence nucléotidique des protéines.

Merci pour la reposes cest bien ce que je supposais. Ça me rassure. Ainsi que pensez vous alors de la citation On raboute a la séquence de nucléotide d'une protéine dite rapporteur. Une enzyme.  [...] On raboute suggère plutôt que l'on est en train de parler de clonage. Il s'agirait donc de l'ADNc que l'on insert dans un vecteur (vecteur d'expression) en phase avec la séquence codante pour une enzyme (betagalactosidase, lucide case, chloramphénicol acétyle transférase, etc).  [...]

[Biologie Moléculaire] Projet de clonage

ce trimestre on fait un projet de clonage du gen-gfp dans pcDNA3.1 et calculer l expression du transgene le gfp gen doit etre apres le CMV promoteur. on doit faire une strategie de clonage ( on est a 7 en groupe) chaqu un doit pense a une strategie et apres on va comparer les resultats.  [...] - Enfin on te demande de vérifier ta construction PCDNA3-GFP une fois que tu l'auras obtenue, c'est-à-dire que tu dois trouver une ou plusieurs enzymes de restriction qui te donneront un résultat différent en fonction de si tu as ton insert ou non. Par ex le choix d'une enzyme pour laquelle tu as 1 site dans ton vecteur PCDNA et un site supplémentaire dans ton insert est idéal car tu auras 1 bande = ton vecteur linéarisé si ton vecteur ne contient pas l'insert, et 2 bandes avec des poids moléculaires bien précis si tu as bien ton insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Il me semble que nous en avions pour notre clonage environ 800 colonies pour 60 ng d'insert et pour le controle nous en avions environ 100, je n'ai pas encore les résultats exactes.  [...] Nous n'avons fait que le controle vecteur sans insert avec ligase, donc du coup j'étais pas mal perturbé mais une fois qu'elle m'a expliqué leur manip et leur résultats, tout a été plus simple (grâce à vos aides aussi, évidemment).  [...]

Hémophilie : un espoir avec la thérapie génique

Une thérapie génique expérimentale menée sur dix patients souffrant d'hémophilie B a donné des résultats encourageants. Le protocole a consisté à injecter un gène codant pour un facteur de coagulation à l'aide d'un vecteur viral.  [...] Pour la première fois, un essai de thérapie génique dirigé contre l'hémophilie laisse entrevoir un espoir de rémission. Grâce à un nouveau virus vecteur, utilisé par des chercheurs anglais, de bons résultats viennent d'être rapportés chez l'Homme. De plus, la méthode pourrait être adaptée à d'autres pathologies.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage Gateway...intérêt ?

-les passages du gène d'intérêt dans le premier vecteur et le passage du premier vecteur au second, ne nécessitent pas d'amplification PCR avec la Taq... donc pas d'incorporation d'erreur de nucléotide par cette enzyme.  [...] Pour l'intérêt de tes 2 plasmides. générallement, ton second vecteur est un vecteur d'expression et non le premier vecteur...le premier vecteur te permet par exemple de séquencer le gène introduit...même si par précaution certains séquencent aussi après insertion dans le second vecteur (comme dit avant, les deux séquences sont censées être identique car pas de polymérase intervenant, il y a uniquement une recombinaison...).  [...]