• Santé - Vecteur, Restriction, Niveau

recombinaison homologue

mutée au niveau de ce gène. Ce gène sert aussi pour l'intégration du vecteur dans le locus.  [...] vecteur est linéarisé par restriction au niveau de ce gène. YIp5 est un exemple de vecteur.  [...]

[Génétique] les vecteurs

s'il vous plait est ce que le site de restriction (au niveau du vecteur) = site d'insertion d'une séquence d'un gene (resistant à l'antibiotique par expl).  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On utilise des enzymes de restrictions pour isoler le gène d'intérêt, son promoteur, etc... et en parallèle on a recours à d'autres enzymes de restriction pour couper le vecteur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

digestion PCR

Bonjour tout le monde, j'ai besoin de votre aide. J'ai un problème avec mon gel.   [...] Après avoir digéré mon insert (un produit PCR avec 2 amorces) et mon vecteur (un plasmide extrait par miniprep) avec 2 enzymes de restriction, je voit sur gel 3 bandes au même niveau. J'ai utilisé un plasmide (extrait de la miniprep) non digéré comme contrôle qui était à un niveau un peu plus bas des autres. Est-ce que c'est normal.  [...]

vecteurs intégratifs

chez S.cerevisiae et d'autre levures, la recombinaison homologue est fréquent. Elle est encore plus favorisée si le vecteur est linéarisé par restriction au niveau de ce gène.  [...] Pour faire de la recombinaison homologue, pour intégrer un transgène par exemple, il faut privilégier la linéarisation de ton plasmide portant un gène d'intérêt. Le plasmide étant d'une forme plutôt circulaire (ce n'est pas exactement vrai en réalité, mais c'est pour simplifier), en le traitant avec des enzymes de restriction adéquates, tu vas le le rendre linéaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Dans tes colonies vecteur+insert il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase. Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle.  [...] Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

par exemple. le pBR322 comprend 2 gènes de résistance l'un à l'ampicilline et l'autre à la tétracycline... celui de la tétracycline contient un site de restriction du BamHI.. ainsi après transformation bactérienne, les bactéries qui ont inclu le vecteur recombinant seront de phénotype Amp R et Tet S.  [...] 2-Les sites de restriction doivent être localisé sur un marqueur de séléction. Donc si je prends comme exemple le vecteur pBR322, je peux utuliser les enzymes de restriction marquees sur la carte du vecteur, qui sont dans ce cas. PvuII, Sty I, BstZ I, Sal I, Sph I, BamH I, EcoR V, Hind III, EcoR I, Sca I, PvuI, PstI.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...] L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...]

[Génétique] Help! tp génétique, analyse clonage

La ligation de l'insert s'est fait au niveau du gène lacZ d'un plasmide. On sélectionne les clones par ensemencement sur différentes boites.  [...] A mon avis, le polylinker offre au vecteur tout un choix de restriction uniques, c'est-à-dire tous différents les uns des autres et n'existant pas, par ailleurs, dans ce vecteur.  [...]