• Santé - Vecteur, Protéine, Système

[Biochimie] Expression protéique

- Si la protéine est membranaire et/ou fait plus de 100 kDa par monomère, c'est quasiment sans espoir en bactérie, change de système (baculo par exemple).  [...] Le problème est que la bande est également mis en évidence chez les témoins négatifs (souche ayant intégré le vecteur sans l'insert). Ceci m'amène à une question. est-il possible que le système bactérien ai détruit ma protéine car elle a été reconnu comme différente par rapport à celle mis en évidence sur le WB.  [...]

[Biologie Moléculaire] Causes d'échecs de la production de protéines recombinantes

c'est vrai que ma question était très vaste d'ailleurs moi-même je n'ai pas de précisions, néanmoins pour le dernier problème je pense qu'il s'agit des tests sur l'homme c'est à dire qu'une protéine qui est efficace sur un modèle murin ne l'ai pas ou l'ai moins sur l'homme donc comment peut-on mieux l'adapter Mais encore une fois le prof n'a pas précisé le type de protéine, le vecteur ou le système d'expression (j'espère que j'ai été un peu plus claire).  [...] Concernant la protéine mal repliée, il a dit que des peptides signaux étaient utilisés afin de l'orienter vers le périplasme car il est moins réducteur que le cytoplasme (formation des ponts dissulfures) et enfin pour le problème lié à l'homme c'était surtout un problème de sécurité donc il faut s'assurer que le système d'expression n'est pas toxinogène par exemple.  [...]

Il y a t'il de l'ADN animal dans les excréments humains ?

Je parle de probabilité très faible car ceci peut aussi se produire avec des aliments non OGM, que la dangerosité dépend éventuellement du type d'OGM, du système immunitaire de la personne concernée, de la présence d'un vecteur bactérien/viral qui ferait intermédiaire, de l'endroit où s'insère le gène, de la capacité de l'ARN issu de ce gène à ne pas être détruit immédiatement / idem pour la protéine qui pourrait en être issue,  [...] A part le réseau de micro-tubule et d'actine, qui permettent de donner une direction (et la lecture ADN en ARN et ARN en protéine), le reste des protéines (et molécules) qui nagent dans le cytosol (et le noyau) aussi ne se déplacent finalement que par des mouvements brownien. Un peu dure à imaginer, je l'accorde.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gfp

Quelqu'un saurait-il me dire s'il est possible d'effectuer une transfection à l'aide d'un vecteur contenant uniquement le gène GFP (ou autre prot fluorescente), çàd sans l'utiliser en protéine de fusion Mon but est de suivre un clone cellulaire que j'utilise en coculture (comme cellules nourricières) avec un autre type cellulaire et à la fin de la manip j'ai une étape de lavage pour me débarrasser de mes cellules nourricières, mais j'aimerai un système me permettant de quantifier ou en tout cas de visualiser ces dernières.  [...] oui c'est tout a fait possible, il existe plein de constructions, adénovirus ou autres permettant l'expression de GFP dans des cellules eucaryotes.   [...]

[Biologie Moléculaire] terminateur rrnb vecteur pMAL

Je viens de cloner mon gène dans un vecteur pMAL pour produire la protéine en système bactérien. Le gène est sous promoteur tac qui permet l'induction par l'iptg, mais du côté C-terminal après la séquence il y a deux régions terminatrices rrnB, que je n'avait jamais vu sur les vecteurs de type pET par exemple.  [...] Quel est l'interêt de ces séquences, pourquoi avoir choisi rrnB et pourquoi 2 régions terminatrices et non une seule.   [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Dans le cadre de mon travail de thèse j'étudie l'expression d'une protéine. Pour commencer j'ai donc cloner le cDNA dans un vecteur d'expression pCDNA3 afin de le transfecter dans des HEK. Malheureusement il n'existe qu'un seul type d'anticorps contre cette protéine et le seul qui existe ne fonctionne absolument pas.  [...] D'où mon idée de fabriquer une protéine de fusion avec la GFP. Malheureusement je ne sais pas trop comment m'y prendre. Malheureusement je ne trouve aucun site en commun me permettant de simplement digérer puis liguer ma GFP avant le codon stop de la protéine.  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

C'est un vecteur d'expression pour la proinsuline et l'écotine. Et dans l'énoncé, il est noté que l'écotine est une protéine dimérique. Du coup, je pensais qu'il fallait faire deux plasmides. Un avec la proinsuline et l'écotine et un autre juste avec l'écotine.  [...] Si l'écotine se dimérise, il suffit de faire un seul vecteur avec un gène fusionnant écotine et proinsuline, et la dimérisation de cette protéine de fusion se fera spontanément via le domaine écotine.  [...]

ubiquitine et protéasome

Je t explique la manip. Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation.  [...] Personellement j'utilise un système de purification sur Nickel. Je transfecte les cellules avec l'ubiquitine taggée (car voir une ubiquitination sans transfecter l'Ubi est impossible pour la plupart des protéines). Si la protéine est connue pour être dégradée par le protéasome, il faut bien entendu ajouter un bloqueur pour la visualiser.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

Quoi qu'il en soit, je vais lire les manuels d'utilisation ce soir et commander un kit baculo demain... J'en ai trouvé d'autres qui produisent de la protéine en 6h, en free-cell, mais la quantité est largement insuffisante pour ce que je veux faire, du coup, l'intérêt que la produise dans un tel système est limité.  [...] Non, ce sont les DO que j'obtiens en 36h en milieu ZYP (auto-inducteur). Quand je fais avec du LB, j'iduis à DO environ 2 (50uM d'IPTG final) et je les arrête à environ 4-5 de DO (de toute manière, elle ne monte pas plus haut dans ces conditions). Le truc est que même dans ces conditions, je détecte la protéine en blot mais je ne la vois pas du tout en bleu de Coomassie.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

3. Pour mieux cerner ton problème, tu commences par répéter ton protocole de production en utilisant le vecteur vide au lieu de ta construction. La GST est une protéine très facile à produire donc tu en auras des tonnes si ton protocole est correct. Rend toi au 4 si tu as beaucoup de GST, sinon rend toi au 7.  [...] 7. Si tu n'arrives pas à produire la GST seule, c'est ton protocole de production qui a un problème. Essaie un autre protocole avec le vecteur vide d'abord puis une fois que ça marchera tu essaieras avec ta protéine de fusion.  [...]