• Santé - Vecteur, Expression, Réplication

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

2-qu'elle est la différence entre un vecteur a replication et vecteur a expression.  [...] Le vecteur d'expression contient en plus de la séquence de résistance et du site de multi-clonage et du site d'origine, il contient en plus un promoteur.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transfection Vecteur d'Expression

Bonjour tout le monde, j'aimerai connaitre les regles lors des experiences de transfection concernant l'insertion d'élements tels que des Proteines fusion, gène de selections je m'explique.   [...] -Lors d'une expression transitoire, l'origine de replication n'est pas requise si j'ai bien compris. puisque le vecteur n'est pas integrer dans le génome, dans ce cas est-ce des élement d'origine procaryote qui permettent sont expression.  [...]

vecteur d'expression

Le vecteur d'expression comprend la partie codant de ton gène, ainsi que des séquence non codante. promoteur, origine de réplication, polylinker... et souvent des gènes de résistances (ampiciline, neomycine...) ou des tag.  [...] Le vecteur d'expression est en général un plasmide circulaire contenant le gène d'intérêt accompagné de tous les éléments nécessaires à sa transcription, une ou plusieurs origines de réplication et un marqueur de sélection (gène de résistance ou autre).  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteur d'expression

Je n'ai pas vraiment compris comment on fabriquait un vecteur d'expression. Je m'embrouille avec ces histoires d'enzymes de restriction et de gènes codant pour la résistance à l'ampicilline, etc.  [...] Les gènes codant pour une resistance à l'ampicilline par exemple permettent de sélectionner les bactéries qui ont reçu le transgène. Mais pour ce qui est de l'amplification pour obtenir de grandes quantités de plasmide, c'est tout bête mais l'origine de réplication permet de répliquer le vecteur dans une même bactérie ou bien chez les cellules filles aprés mitose.  [...]

[Biotechnologie] Insuline

J'ai choisi comme système d'expression Pichia pastoris, mais j'ai crée le vecteur recombinant dans E.coli.  [...] Il va falloir que tu utilises un vecteur possédant un gène de sélection (HIS4 par exemple), une origine de réplication et un promoteur fort (généralement celui de l'alcool oxydase AOX1) compatibles avec pastoris. Invitrogen propose des plasmides pour l'expression chez pastoris mais je n'en sais pas plus.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr/clonage

La PCR va permettre d'isoler et amplifier un fragment d'intérêt qui va ensuite être intégré dans un vecteur. Lorsqu'on fait un clonage ou un sous-clonage, on souhaite exprimer ce fragment qui dans la plupart des cas correspond à l'ADNc codant une protéine ou une partie de la protéine.  [...] Il faut donc un promoteur en amont du fragment pour qu'il soit transcrit, il faut des séquences d'initiation de la transcription pour l'expression chez une bactérie, une séquence ori qui permet la réplication du vecteur et de son insert. Tout ceci se trouve dans un vecteur et est indispensable à l'utilisation du fragment isolé.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.  [...] Pas besoin de sélectionner si c'est du transitoire, en revanche il faut s'assurer que les meilleures conditions ont été choisies pour voir une expression, tu transfectes les cellules auquel cas, il faut tester plusieurs conditions de transfections, différentes quantités de vecteurs avec différentes quantités en excès de lipofectamine ou autre transfectant, car tu es peut-être dans des conditions ou tu ne transfectes pas beaucoup, puis tester l'expression à 24h et 48h post-transfection comme l'a proposé Yoyo.  [...]

[Biologie Cellulaire] vecteurs

- le fait de pouvoir induire l 'expression d'un gène permet de s'assurer que le phénomène observé n'est pas lié à l'introduction du vecteur lui-même. ainsi, c'est uniquement au moment où l'on induit l'expression qu'il se passe quelque chose de significative, et quand on l'arrête, le phénomène n' a pas lieu.  [...] Oui, on retrouve tous ces éléments dans les deux types de vecteurs. Ce qui change, c'est la nature des signaux d'initiation de transcriptions (constitutifs ou inductibles) et, pour les vecteur d'expression transitoires, des gènes codant des répresseurs/inducteurs (voir le système tetON/ tetOFF).  [...]

[Biotechnologie] vecteur de clonage et vecteur d'expression

Un vecteur d'expression possède, en plus, des séquences permettant l'expression de l'ADN de l'insert.  [...] * promoteur (eucaryotes ou procaryotes selon ce qui est recherché), séquences d'initiation de la transcription au sens large, terminaison de la transcription,   [...]

Problème de rendement kit Maxiprep

et aussi que ton gène ne peut pas etre la cause, par exemple si c'est un inhibiteur de réplication, une nucléase non spécifique... quelque chose qui ferait que c'est l'expression de ce gène par la bactérie qui entrainerait le problème.  [...] Du coup, si c'est la nature du gène qui pose problème (inhibiteur de réplication, nuclease ou autre), cela signifie qu'il y a une activité résiduelle de l'expression de mon vecteur dans ma cellule Est-il possible de bloquer cette activité.  [...]