• Santé - Vecteur, Clonage, Plasmide

[Biochimie] Etude des partenaires protéiques : Co-Immunoprécipitation, Tap-Tag et double hybride

pour créer une protéine de fusion, il te faut les cDNA des deux protéines. Tu les insere dans un vecteur à la suite, en prenant soin de les mettre en phase et en supprimant le codon stop de la premiere, comme ça tout est traduit en une fois. A ma conaissance on fait du double hybride chez la levure puisque ca n'est pas un procaryote.  [...] Et le vecteur utilisé pour le clonage, de quoi s'agit-il Plasmide, cosmide, YAC Et comment ce vecteur s'exprime chez la levure Le gène rapporteur, il se situe où Il faut forcément que l'organisme qui exprime les protéines fusions soit un eucaryotes.  [...]

Clonage dans un vecteur

bonjour. je voudrais savoir comment peut-on augmenter l'efficacité du clonage des fragment d'ADN d souris dans les vecteurs.  [...] On pourrait presque dire que chaque clonage est différent. il y a pas mal de paramètres à prendre en compte. taille de l'insert, taille du plasmide, technique de transfo, conditions de ligation (ratio insert/vecteur, température, durée, Unités de ligase, bouts francs, cohésifs), etc. etc.etc.  [...]

Correction devoir - Le monde microbien , biotechnologie, antibiotiques …

1) Sachant que les bactéries de type Rhizobium ne se développent bien que dans les racines des légumineuses et que ces plantes se procurent, grâce à la présence de ces microbes, des matières azotées nécessaires à leur fonctionnement, expliquez pourquoi l'union entre ces bactéries et les légumineuses est une association nommée symbiose.   [...] Il fait peut être référence au colonie blanc/bleu et au système d'induction à l'IPTG pour savoir si le fragment cloné est bien intégré dans le plasmide.  [...]

[Biologie moléculaire] Linéarisation de vecteur PGEMt pour faire des sondes HIS

J'ai une petite question concernant le vecteur PGEMt. Ce vecteur comprend un site multiple de clonage (avec mon insert d'intérêt) ainsi que des sites d'initiation de la transcription T7 et SP6. Je me demandais s'il était nécessaire de linéariser le plasmide avant de faire agir les polymérases SP6 et T7 ou bien s'il est prévu dans le plasmide des sites d'arrêt de transcription.  [...] Je sais qu'il existe des sites de terminaison de la transcription (paires de GC, structures secondaires, signal de polyadénylation.. en fonction de si on se place chez des procaryotes ou des eucaryotes) mais j'ai beaucoup de mal à trouver l'information pour le vecteur PGEMt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gène0 AOX1!!

1) Enzyme de restriction spécifique à AOX1 ainsi qu'au plasmide vecteur de clonage. Donc découpage des deux au bon endroit.  [...] En effet je n'ai pas très bien compris les mécanismes qui menenet à la multiplication des plasmides vecteur de clonage qu'on insère dans une bactérie.  [...]

Manipulations génétiques

Pour intégrer un gène d'intéret dans un génome, c'est assez compliqué, je me ferai un plaisir de t'expliquer si tu connais les notions de PCR, séquences nucléotidiques complémentaires, arn polymérase, plasmide, vecteur, recombinaison homologue ^^.  [...] Ensuite tu peux insérer ton gène dans un plasmide vecteur (procédé encore compliqué, avec des notions de multi site de clonage etc etc ^^).  [...]

Questions sur les éléments d'un vecteur de clonage

-Une fois la transfection effectuée, on doit sélectionner les bactéries ayant bien reçus ce plasmide sur milieu avec antibiotique. Encore une fois, ce fameux codon stop empêche selon moi la transcription du gène de résistance et donc ne permet pas aux bactéries de devenir résistantes.  [...] L'expression des différents gènes contenus dans un tel plasmide est indépendante. Même s'il y a en effet un codon stop après le MCS, il y a des promoteurs indépendants pour chacun des autres gènes comme celui de résistance. Du coup je pense que cela répond a toutes tes questions, sinon tu peux toujours continuer la discussion.  [...]

[Biologie Moléculaire] pCMX vecteur

Je viens de recevoir le vecteur d'expression pCMX mais l'expéditeur ne possédait pas la séquence ainsi que la carte. J'ai regardé sur le net mais impossible de trouver les caractéristiques de ce plasmide. J'aimerai savoir si quelqu'un possède ces informations ou sait où je peux les trouver.  [...] C'est le problème de la sous-traitance. Certains sous-traite leur travail (le clonage en particulier) et ne demandent pas les caractéristiques du plasmide du moment ou ils possèdent leur gène d'intéret dans un vecteur d'expression.  [...]

[Biologie Moléculaire] difficulté plasmide lentiviral

J'ai un problème de clonage d'un petit oligo (shRNA) dans un vecteur lentiviral qu'il faut digérer AgeI/EcoRI pour le site de clonage. Sauf que mon problème se révèle bien plus basique que cela, après quelques déboires, je viens de me rendre compte que je n'arrive même pas à obtenir des clones après transfo de mon plasmide simplement digéré EcoRI OU AgeI et religué sur lui-même.  [...] .. Le plasmide non digéré se transforme sans problème même si après une nuit à 37°C les clones sont assez petits. Pour info, il est conseillé d'utiliser des bactéries déficientes pour la recombinaison avec ce plasmide, donc j'ai utilisé des SURE2. Je précise aussi qu'après avoir constaté que j'avais un problème basique dans ma ligation, je l'ai refaite avec nouvelle ligase et nouveau tampon de ligase et.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Lors d'une transformation transitoire, est ce que les histones se lient a l'ADN du vecteur pour former des nucléosomes ou la petite taille du plasmide empêche justement les nucléosomes de se former Observera-t'on une différence entre un plasmide eucaryote et un plasmide bactérien au niveau de ces nucléosomes.  [...] Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.  [...]