• Santé - Transformation, Bactéries, Vecteur

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Donc effectivement, on peut avoir culture sur le contrôle puisque le vecteur est résistant à l'ampicilline (j'ai tendance à pas mal m'embrouiller avec tout ça). D'après ce que tu dis pour le contrôle négatif, un vecteur qui n'a pas inséré d'insert ne va pas entrer dans les bactéries lors de la transformation bactérienne et du choc thermique Le vecteur ne peut pas entrer seul dans les bactéries.  [...] En ce qui concerne l'efficacité de ta transformation (vecteur+insert) elle n'est que de 13.10^3 bactéries transformées/µg d'ADN ce qui est faible (une valeur de 10^6 est en général souhaitable).  [...]

[Biologie Cellulaire] Stockage des bactéries thermocompétentes?

Après transformation de ces bactéries (avec mon vecteur et le vecteur de contrôle), je n'ai obtenu aucune colonie sur boite de pétri.  [...] C'est possible, la stabilité d'un plasmide est souvent lié à son utilisation par la bactérie, si celui ci n'apporte aucun avantage sélectif, celui ci sera délété (avantage sélectif, pas besoin de le dupliquer, de le transcrire/ traduire, etc.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

ma ligation est optimisée (sur la nuit), rapport vecteur/insert 1.10. mes bactéries sont compétentes108B/µg ADN. après transformation, aucune colonie.  [...] Rapport vecteur.insert 1.10 ok mais tu utilises quelle quantité exactement d'ADN Et tu transformes avec quelle volume de ta ligation (pour quel volume de bactéries ).  [...]

Transfert horizontal gene

Les transferts de gènes sont déjà très utilisés en génie génétique. que ce soit transduction (un virus sert de vecteur entre deux bactéries), conjugaison (contact via des pili entre deux bactéries) mais surtout transformation (une bactérie prélève de l'ADN dans son milieu de vie).  [...] C'est simplement. transfert horizontal de gènes, donc je pensais parler de la syncitine avec un point de vue évolutif mais aussi de la bactérie Zobellia.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

Est-ce que vous rajoutez bien la BSA qui est nécessaire pour un clivage optimal par Sfi1 Quel contrôles intra-manip avec vous fait (contrôle de clivage par l'enzyme, de recircularisation du vecteur,...) Quelles bactéries utilisez-vous pour la transformation Avez-vous fait le contrôle de base nécessaire sur la transformation des bactéries. transformation avec un plasmide contrôle.  [...] Puis transformation de 20 µl de bactéries chimiocompétentes avec 8 µl de produit de ligation. Ca marche très bien mais tes conditions semblent assez proches, tu dis qu'une autre ligase a donné les premiers résultats donc c'est sur la bonne voie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

Pour choisir un vecteur, il te faut regarder la force de l'origine de réplication (qui détermine le nombre de copies de plasmide dans la bactérie), les résistances aux antibiotiques (sélection des bactéries intégrant le plasmide), la présence d'autres marqueurs de sélection comme la beta-galactosidase, le type de système d'expression (promoteur euca/procaryote, RBS pour traduction chez procaryote,  [...] par exemple. le pBR322 comprend 2 gènes de résistance l'un à l'ampicilline et l'autre à la tétracycline... celui de la tétracycline contient un site de restriction du BamHI.. ainsi après transformation bactérienne, les bactéries qui ont inclu le vecteur recombinant seront de phénotype Amp R et Tet S.  [...]

[Biologie Moléculaire] cellules compétentes DH5a

Si ca se trouve vous avez une contamination de votre environnement (pipettes) avec un vecteur qui transforme vos bactéries à votre insu (de très petites quantités de plasmide suffisent à transformer).  [...] le vecteur possede un gene de resistance a l'ampicilline et apporte donc la resistance à l'ampicilline quand il transforme une bactérie DH5a. Or si la bacterie est deja resistante a l'ampicilline avant la transformation, tu ne peux pas distinguer les bactéries transformées des bacteries non transformées resistantes à l'ampicilline.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage TOPO dans JM-109

J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).  [...] le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel). 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).  [...]

bactéries (reproduction)

La conjugaison est un phénomène permettant l'échange d'information génétique entre une bactérie donneuse et une bactérie reçeveuse, qui devient donc modifiée. Elle est assimilée à une reproduction sexuée car on peut y voir une analogie avec la reproduction des Eucaryotes.  [...] La transduction n'est pas un mode de reproduction bactérien. C'est un phénomène lié à l'attaque d'un bactériophage. ce dernier ayant encapsidé de l'ADN du génôme de la bactérien pr écédemment infectée à la place d'ADN viral. La bactérie infectée par ce phage particulier peut être ainsi modifiée génétiquement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

J'ai testé les différentes propositions que vous m'avez faites. J'ai pu obtenir des colonies ce matin. Seulement, il y a un souci, j'ai des colonies dans ma transformation témoin (bactéries transformées avec le vecteur ligaturé sur lui même). Je vais prendre le pari ce matin et essayer de faire des PCR de colonies pour voir si les fragments d'intérêt on bien été cloné.  [...] Je suis également nouvelle sur le forum. Cette discussion a attirée mon attention car moi aussi j'essaye de sous-cloner un insert de 4kb dans un vecteur pET28a (5.4kb) depuis 2 semaines je n'y arrive pas. J'ai toujours quelques colonies après transformation mais lorsque je vérifie si la ligation a fonctionner je ne retrouve pas mon insert.S.  [...]