• Santé - Transfert, Protéine, Western

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Je cherche le moyen d'optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire. Je travaille sur FAS (274kDa) et je n'arrive pas à la transférer.  [...] Cependant, si tu arrives à transférer des bandes plus lourdes que ta protéine, ton problème ne vient probablement pas du transfert à moins que taprotéine ait une composition en acides aminés très atypique (c'est rare pour une protéine géante). Il faudrait donc être certain que la protéine que tu cherches est bien présente et que ton anticorps la reconnait efficacement dans les conditions ou tu l'utilises.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

je relance le fil car j'ai un problème pour un WB d'une protéine de haut poid moléculaire et je pense que c'est le transfert qui cloche (en désespoir de cause).  [...] Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont coulantes comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire.  [...]

[Immunologie] immunoblote

Tu dépose l'échantillon protéique sur SDS-PAGE après migration tu fait agir l'anticorps dirigé spécifiquement contre la proteine que tu veux détecter. Cette anticorps est couplé à une enzyme ou un fluorochrome comme sa après lavage si tu detectes l'activité enzymatique ou la fluorescence sa veux dire que l'anticorps est présent est donc que le protéine est présente.  [...] Pour le western c'est un transfert électrique des protéines alors que l'immunoblot c'est un transfert qui se fait sous vide de pression.  [...]

[Biochimie] Problème avec mon western

J'ai un souci avec mon western blot sur SDS-Page, la migration et le transfert se sont bien déroulés, la première révélation de ma protéine d'intérêt s'était nickel.  [...] la technique proposée par Gorben est bonne, sauf si tu fais ton western pour la premiere fois et que tu ne sais pas comment tes AC I réagissent. Car si jamais ils donnent des bandes aspécifiques et que manque de bol tu en as aux alentour du poid moléculaire d'une de tes protéines tu risques d'interpréter un artéfacte, il faut donc etre tres vigilant.  [...]

[Divers] Probleme western blot!!

Bonjour, depuis quelques temps j'ai un problème avec mes western, il n'y a pas de proteine de haut poids moléculaire. pourtant comme vous pouvez le voir il ne s'agit pas d'un problème de transfert car certain échantillon ainsi que le marqueur ont des proteines de haut poids.  [...] La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines. les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse).  [...]

[Biochimie] Western blot

Cependant une personne de mon équipe a réalisé un transfert d'une très grosse protéine (. 300 kDa) et il a un tampon de transfert adapté, pris d'une publie. Il réalise son transfert à 20V à 4°C et a noté une nette amélioration du transfert des marqueurs de haut poids moléculaire comparé aux méthodes classiques.  [...] très intéressante cette discussion. Effectivement, est-ce qu'il serait possible d'avoir la référence de la publication sur l'utilisation du tampon de transfert pour les grosses protéines.  [...]

[Biochimie] Modifications post traductionnelles et électrophorèse !

Non pas à ma connaissance. Pour mes protéines après migration à 80V dans le stacking et 130V dans le separating, je transfère en liquide pendant 1h30 à intensité fixe 350 mA, puis les autres étapes sont inchangées par rapport à d'autres westerns sur d'autres protéines.  [...] Perso j'utilise un marqueur de PM colore ca aide en rien le transfert, mais comme ca tu sais immediatement si les proteines de haut PM ont ete transfere ou pas (pas besoin de se faire un western dans le vide).  [...]

[Biologie Cellulaire] mise en évidence d'une phosphorylation

Déjà, afin d'être sûre que la PKA ou la PKC phosphoryle la protéine in cellulo, vous pouvez transfecter des siRNA spécifiques de la PKA ou de la PKC et regarder si le marquage phosphosérine/phosphothréonine diminue voire n'apparait plus en western blot. La manip inverse peut aussi être une validation supplémentaire c'est à dire transfecter un plasmide surexprimant la PKA ou la PKC et regarder en western blot si le marquage par l'anticorps anti-phosphosérine/thréonine augmente.  [...] Après mutagenèse, vous transfectez la construction mutante dans les cellules, elle agira comme dominant négatif de cette phosphorylation sur la protéine endogène et normalement en western blot anti-phosphosérine/thréonine vous aurez une diminution ou abolition du signal.  [...]