• Santé - Transfert, Bandes, Membrane

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont coulantes comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

question à priori simple, je voudrais savoir quel est le rôle de la vérification au bleu de coomassie des gels après transfert sur membrane. A priori cela permettrai de montrer qu'on a bien toutes les bandes sur gel mais j'comprends tjrs pas en quoi ça signifie que toutes ces bandes sont bien sur la membrane, puisque logiquement on ne doit voir sur la membrane que ce qui peut être révéler par l'Ac II.  [...] colorier ton gel au bleu apres le transfert te permet de vérifier que toute les bandes qui étaient a l'origine dans le gel ont disparus et qu'elles sont donc sur la membrane.  [...]

[Microbiologie] western blotting

j'ai fait migrer mes protéines par sds page en puits confondus, sur le gel les bandes sont nettes, en faisant le transfert sur membrane de nitrocellulose et après révélation par le 4 chloro1 naphtol je n'ai pas obtenu des bandes pourquoi à votre avis sachant que le transfert s'est bien passé j'ai dilué les anticorps primaires 1/100 et les anticorps secondaires 1/2000 je doute par rapport au titre des anticorps que j'ai utilisé sachant qu'ils proviennent des patients atteints de Mycoplasma pneumoniae qu'est ce que je dois faire.  [...] Le rouge ponceau est aussi pratique pour vérifier qu'il y a bien des protéines sur la membrane, les étapes de blocages peuvent parfois etre problématiques. J'ai parfois observé qu'un blocage plus court améliorait les signaux.  [...]

[Biochimie] le native PAGE !! et western blot "natif"

j'aurais voulu savoir si quelqu'un par ici a l'experience du native PAGE et surtout du transfert sur membrane derrière.  [...] en effet j'ai une proteine positive à faire migrer pour cela j'avais inversé les bornes lors de l'electrophorèse afin qu'elle puisse migrer tranquillement vers le moins et pareil lors du transfert (sauf que la j'avais inversé la membrane et le gel) et le resultat à la fin est assez surprenant vu que mon anticorps semble detecter quelque chose mais ca ne donne pas des bandes mais on dirait juste une membrane degueu.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Rapidement...pareil, pas d'ajustement de pH et remplacement du methanol par de l'ethanol. Le retrait de l'ethanol peut ameliorer le rendement de transfert de proteines de haut poids moleculaire. On peut supprimer l'ethanol avec les membranes de PVDF, pas conseille avec les membranes de nitrocellulose.  [...] Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...]

[Biochimie] Dot Blot et Northern Blot

Le nothern blot, on fait migrer des ARN dans un gel afin de les séparer. On les transfère sur une membrane et on révèle la ou les bandes qui nous intéressent grâce à l'hybridation de sonde ribonucléiques marquées.  [...] Mais c'était un dot blot ou un colony lift Moi quand j'ai eu à screener la présence d'un gène comme tu l'as fais j'ai préféré le colony lift (réplique des colonies sur une membrane nitrocellulose puis en gros l'équivalent d'un southern blot). En revanche je n'ai pas déposé directement l'ADN extrait de chacune des colonies gouttes à gouttes sur la membrane.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

Le problème est que je souhaite confirmer que la bande présente sur mon gel est bien celle de ma protéine, donc je réalise un WB afin de localiser spécifiquement ma protéine d'intérêt. J'ai un gros soucis lors du transfert de ma protéine du gel vers la membrane PVDF.  [...] Apres activation, tu as mis équilibrer ta membrane dans le tampon de transfert (Les tampons de transfert doivent être à 4°C).  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Jusque là tout va bien mais malgré un bon nombre d'essai je n'arrive pas à avoir un transfert complet de mes extraits protéiques sur ma membrane. Ma protéine fait 80 kDa et j'utilise un appareil de transfert liquide (Bio-Rad) avec des membranes de nitrocellulose.  [...] Préalablement au transfert, j'équilibre ma membrane pendant 10 à 20 minutes dans le tampon de transfert et je laisse mon gel 30 min avec agitation dans le tampon de transfert pour enlever le SDS.  [...]

[Immunologie] Westernblot

Nous avons séparé le gel en 2 parties, une coloré au bleu de Croomassie et l'autre pour le transfert. Après transfert (séparé en 5 bandes), nous avons utilisé le NHS-biotine (sans anticorps) sur une des bandes. Les 4 autres bandes ont servi pour une réaction immunoenzymatique.  [...] Je dois répondre à cette question. Quelle est l'utilité d'avoir utilisé le bleu pour le gel et la biotine pour la membrane Quelle est la différence entre le bleu de Coomassie et le NHS-biotine.  [...]

Problème de séparation - Western blot

J'ai un problème assez bizarre. Lors de mon western blot, juste avant d'arrêter la migration, j'ai remarqué que mon marqueur de poids moléculaire ne s'était pas séparé et était resté entier, par contre il a bien migré jusqu'en bas du gel, de même pour les échantillons.   [...] Il faut savoir que j'ai poursuivi jusqu'à la révélation et j'ai obtenu des bandes blanches sur une membrane noire (l'inverse de ce qu'on devrait avoir en gros) et les bandes blanches étaient tout en bas de la membrane, rien ne s'est séparé en fonction du poids moléculaire et tout est au même endroit, je pense que la bande blanche est due à ça. signal trop fort car tout au même endroit.  [...]