• Santé - Température, Hybridation, Amorces

Conditions experimentales PCR, test primers !

Mon travail consiste a tester des couples d'amorces (primers F/R) afin de determiner les conditions experiementales pour leur utilisation. J'ai testé ces amorces avec une temperature d'hybridation standard donnée par les differents protocoles de PCR. 55°(diferente de celle indiquée sur les etiquettes des tubes des amorces) et la plus part de mes couples d'amorces ne donne pas de signal ou de signal specifique.  [...] . toutes vos idées à propos de ce que je fais me seraient utiles. determiner les bonnes conditions experimentales pour l'utilisation de differentes couples d'amorces (primers), comment savoir la bonne temperature d'hybridation, comment savoir combien de cycles de PCR pour chaque amorce.  [...]

[Biologie Moléculaire] calcul de la température d'hybridation

je veux effectuer une PCR mais le probleme se pose dans le calcul de la température d'hybridation des amorces, en attente de votre aide je vous remercie.  [...] La Th (température d'hybridation) est 5 à 10°C plus faible que la Tm des amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR et température d'hybridation

J'aimerais savoir pourquoi augmenter la température d'hybridation permet une bien meilleure hybridation des amorces.  [...] Expérimentalement, il est constaté que la PCR fonctionne même avec une phase d'hybridation avec une température supérieure de quelques degrés au Tm théorique des amorces, probablement parce qu'elles interagissent déjà avec les polymérases, qui stabiliseraient leur hybridation à l'ADN matrice.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Ta température d'hybridation est faible, quel est le Tm de tes amorces Peux tu nous donner la séquence de tes amorces pour les checker.  [...] A une température aussi basse d'hybridation, la stringence étant moins forte il peut y avoir une formation de structures secondaires empêchant la PCR, sur les amorces ou sur la matrice. Essayes une température plus haute comme le recommande YouLab, à 60°C, cela peut résoudre ton problème.  [...]

Température d'hybridation et PCR

J'ai déterminer un Tm de 52°c avec les amorces mais dans l'article ils utilisent une température d'hybridation de 54°. est-ce parce que en dessous de 54° l'hybridation n'est plus assez spécifique.  [...] Maintenant pourquoi on se place 5°c en dessous du Tm pour avoir la température d'hybridation J'y pense maintenant ça doit être un compromis entre une dénaturation suffisante de l'ADN (ou plutôt une renaturation pas trop rapide de l'ADN après l'étape de dénaturation pour permettre l'hybridation aux amorces) et une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation (d'où 5° en dessous du Tm). Non.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : bandes aspécifique et température

J'ai commencé avec une température d'hybridation volontairement inférieur à celle du Tm de mes amorces car j'ai amplifié un autre insert dans le même programme de PCR.  [...] Comme cette fois je n'avais qu'un seul produit à amplifier j'en ai profité pour augmenter ma température hybridation afin d'être plus proche des Tm de mes amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR? - Page 2

J'ai deja commande les amorces mais les miennes ont 21nt de part et d'autre de la mutation que je veux introduire, penses-tu que je peux les utiliser quand meme ou dois-je en commender d'autres.  [...] Pour l'hybridation des amorces, je prends cette température quelque soient les Tm, qui de toute façon sont beaucoup plus élevés. En général, amorces de 22nt avec le résidu muté au milieu.  [...]

températures et PCR

La température d'hybridation c'est celle qui permet que les amorces se fixent à la matrice si je comprends bien et le Tm c'est la température a laquelle il y a 50% de simple brin mais je n'arrive pas a faire le lien avec les amorces parce que ça c'est la dénaturation non.  [...] Pour que tes amorces puissent s'hybrider à la matrice d'ADN, il faut que celle-ci sois dénaturée pour permettre l'accessibilité des amorces. Ainsi à Tm-5°C on considère que l'hybridation peut se faire correctement. Et oui, le Tm est la température à laquelle tu as 50% de ton ADN sous forme simple brin (et donc 50% en double brin).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de PCR

Pour la faible quantité. pas assez d'enzyme ou enzyme pas efficace, pas assez d'amorce, pas assez d'ADN, contamination des échantillons, machine à PCR dérègler.  [...] J'ai oublié (mais mes énumérations ne sont pas exhaustives.). si la température d'hybridation des amorces est trop basse ( = stringence diminuée), l'amplification est moins spécifique aussi.  [...]

séquençage de l'ADN

J'aimerais savoir comment faire pour connaitre la séquence de l'amorce pour le séquençage d'un gène en utilisant la méthode de sanger.  [...] 3°) On va ensuite concevoir un ou plusieurs couples d'amorces à tester en PCR (différentes paramètres à optimiser comme la température d'hybridation, la concentration en sels,...).  [...]