• Santé - Tampons, Lavages, Protéines

immunoprécipitation protéique

J'aimerai savoir quelle est la composition des tampons de lavages et d'élution qu'on utilise pour une manip d'immunoprécipitation de protéines.  [...] ca depends de ce que tu veux immunoprécipiter comme protéine et avec quel spécificité. Ca depend aussi evidemment de quel organisme tu parts.  [...]

[Biochimie] Fixer des protéines dans un gel

Par contre, dès que j'essaie de les fixer (avec du TCA, par exemple), là, je perds carrément les petites protéines (diffusion dans le tampon de fixation + dans les lavages, probablement), et les grosses sont également plus faibles.  [...] Je vais proposer un truc barbare... Avant de faire sécher, en passant la plaque dans un microonde pleine puissance quelques seconde, les protéines seront peut-être dénaturées et ainsi fixées... Mais c'est barbare... Y'a des protéines qui seront franchement abîmées.  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

- Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration. à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.  [...] Concernant le rôle exact des tampons utilisés dans les lavages, je ne peux pas trop t'en dire plus. Qiagen, c'est vrai, restant très secret sur la formulation de leurs produits.  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunocytolocalisation - Anticorps primaire 3-4h ?

PS. Je pense que tu le sais déja, mais si ta protéine est intracellulaire, quoiqu'il arrive il faudra perméabiliser tes cellules. La PFA est très bien pour cela, fixateur et permeabilisateur en même temps.  [...] En tout cas, je vous confirme bien que cela fonctionne. Comme je n'avais pas encore lu les dernières réponses, j'ai fait 30 min de fixation, blocage au lait 10% pdt 1h, 3h d'anticorps primaire et 1h d'anticorps secondaire.   [...]

[Biochimie] Précipitation des protéines.

Il y a une étape ou j'aimerais bien précipiter un maximum de protéines présentes dans ma solution seulement je ne sait pas trop quelle méthode employer (je pencherais plutôt pour un solvant organique, mais lequel). les protéines récupérée me serviront à faire une électrophorèse.  [...] Oui ça marche très bien. précipitation dans 4 à 5 volumes d'acétone (minimum 20 min à -20°C), centrifugation pour récupérer les protéines (15000g pendant 10 min) + 2 ou 3 lavages.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Les extraits protéiques sont dénaturés à 95°C pendant 5 minutes en présence de LSB 1X final avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6%. Les immunoprécipitations sont dénaturées à 95°C pendant 5 minutes dans 25 µl de LSB 2,5X. Après migration électrophorétique, les protéines sont transférées en milieu liquide sur une membrane de nitrocellulose (HybondTM C Extra, Amersham Bioscience) pendant 1h30 dans un tampon de transfert (50 mM Tris base, 40 mM Glycine, 1,3 mM SDS et 10% éthanol).  [...] Après plusieurs lavages, les protéines d'intérêt sont révélées par chimioluminescence (Kit ECL+, Perbio) et détectées par une caméra CCD.  [...]

[Biochimie] Dégradation de protéines dans l'urée 8M

J'ai un petit problème dans une des mes expériences. Je produits des protéines dans des E. coli en corps d'inclusion. J'effectue un protocole de récupération de ces corps d'inclusion assez long mais efficace (pour l'avoir testé sur deux autres protéines).  [...] Ce protocole a fonctionné pour 2 protéines mais pour la 3eme un problème survient dans la purification. La protéine se charge correctement sur la colonne (je n'ai presque rien qui ne s'accroche pas), elle résiste aux lavages et au moment de l'élution je me retrouve avec une bande beaucoup plus basse, comme si la protéine avait été tronquée ou digérée.  [...]

[Génétique] kit qiagen

Ceci dit, à peu de choses près, on sait tous ce qu'il y a dans les solutions des kits surtout pour une technique aussi simple que l'extraction de plasmides. Dans les tampons de lyse tu as du SDS et de la soude (pH 12-13), dans la seconde solution de neutralisation tu as un agent acide, les solutions de lavages sont à bases d'alcool, le TE est du Tris-EDTA et la colonne contient une résile en silice.  [...] Petit complément, la solution acide contient certainement de l'acide acétique vu l'odeur, en plus du fait que c'est souvent cet acide qui est utilisé en biologie moléculaire. L'alcool des lavages permet de conférer une certaine hydrophobicité aux solutions de lavages.  [...]

[Biochimie] Différence entre tween, triton x, NP ... ?

Voilà, je voudrai utiliser un detergent non ioniques (le moins dénaturant possible pour mes protéines) pour diminuer les adsorptions non specifiques d'anticorps ou autre protéines d'interet sur un test qui se rappoche de l'ELISA.  [...] Courament pour des manip avec des protéines on utilise du PBS-tween 20 0.05%-0.1% ou du PBS-triton X100 0.1% (note que tu peux remplacer le PBS par du TBS (Tris buffer salin), des fois ca peut aider). En théorie on peut utiliser un blockage au régilait ou à la BSA.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

Je ne comprends pas bien. On peut tout à fait faire un western avec SDS et utiliser un anticorps couplé à la péroxydase. Le SDS agit pendant la migration mais une fois que les protéines sont sur la membrane, il n'y a plus de SDS et si il en reste il disparaît avec les lavages donc aucun problème pour la péroxydase (et d'ailleurs intuitivement ça coule de source car les anticorps que vous allez utiliser, avant la péroxydase, nescessitent leur conformation 3D ce qui prouve que le SDS ne bouleverse pas la manipe une fois que l'on est sur la membrane).  [...] Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad.  [...]