• Santé - Tampon, Transfert, Méthanol

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Au début j'utilisais un tampon de transfert contenant 20% de Méthanol avec 25 mM de Tris Base et 190 mM de Glycine. J'ai entre temps diminuer la concentration de Méthanol à 10% et j'ai donc observé un meilleur transfert. J'ai aussi essayé avec des gel de 0.  [...] Je compte essayer demain un transfert overnight et peut être essayer avec un tampon de transfert sans méthanol. Donc si quelqu'un à une idée je suis preneur.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

Je sais que nous on réutilise le méthanol dans lequel on a trempé la membrane car apparemment on a pas le choix d'utiliser du méthanol par contre pour le tampon de transfert, on peut utiliser de l'éthanol à la place du méthanol.  [...] Je confirme, méthanol pour mouiller la membrane c'est mieux, il suffit de tremper dans quelques ml sous la sorbonne, 30 sec juste histoire de mouiller la membrane, rien de si contraignant... Ensuite on peut la mettre à équilibrer dans le tampon de transfert pour lequel on utilise de l'éthanol.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

ok merci je vais déjà vérifier ces points, j'active ma membrane 15 sec dans du methanol puis qq'secondes dans l'eau puis qq'minutes dans le tampon de transfert.  [...] es ce que tu pourrais nous donner la composition de ton tampon de transfert meme si je doute que le problème vienne de la étant donnée que le marqueur passe bien.  [...]

[Biologie Cellulaire] membrane PVDF et methanol

tout pareil, dans l'activation de la membrane comme dans le tampon de transfert, le methanol est substituable par de l'EtOH100%.  [...] Merci d'accord il vaut mieux utiliser l'éthanol que le méthanol. Mais pourquoi utilise t'on ses solutions avant le transfert, je pense que c'est pour une sorte d'activation mais concrètement cela fonctionne comment.  [...]

[Biochimie] Questions Coomassie et Western Blot

Le méthanol et l'éthanol rendent le gel plus poreux, ce qui permet de faciliter les échanges avec le tampon (que ce soit de transfert ou de staining en coomassie). Cela permet une meilleure pénétration du coomassie dans le gel pour colorer les protéines, et cela facilite la sortie des protéines du gel pour le transfert.  [...] Pour le transfert, les solvants ont un intérêt beaucoup plus forts car ils permettent la dissociation du SDS des protéines, ce qui permet aux protéines d'interagir avec la membrane de PVDF par interactions hydrophobes et électrostatiques, mais pas ioniques comme l'exigerait une interaction avec le SDS.  [...]

[Biochimie] Western blot methanol

Non nath parle plutôt de l'étape précédent la constitution du sandwich de transfert. On trempe rapidement la membrane de PVDF dans le méthanol suivi d'un rinçage à l'eau distillée. Avant cette étape, la membrane de PVDF est hydrophobe puisque la plonger directement dans l'eau ne la mouille pas.  [...] Je suppose donc que la tremper dans le méthanol doit dissoudre partiellement la surface hydrophobe de la membrane, révélant ainsi les sites hydrophiles permettant à la membrane de ne pas repousser les molécules polaires comme l'eau, et donc de bien faire contact avec le tampon de transfert.  [...]

[Biochimie] Western blot en pointillés

Certaines protéines sont capricieuses lors du transfert. Tu utilises du PVDF, tu transfères en méthanol sans SDS Tu fais 30V combien de temps.  [...] Avant je faisais un transfert identique à toi au niveau chimique (PVDF, méthanol sans SDS), 1 heure 30 à 400mA constant. J'avais les protéines de haut poids moléculaire qui se transférait mal vu avec les marqueurs de taille + PARP non clivé (110 kDa). Du coup je suis passé au même transfert mais d'une durée de 2h15-2h30.  [...]

[Biochimie] Western blot

L'incubation de la membrane de nitrocellulose avec le methanol est important avant le transfert même si aujourd'hui on à des membranes d'assez bonnes qualité.  [...] Les membranes de PVDF doivent être mouillées en méthanol. Si tu ne le fais, ton transfert ne marchera pas. Par contre, il me semble que la nitrocellulose n'a pas besoin d'être trempées dans le méthanol.  [...]

[Biochimie] Western Blot

D'ordinaire je transfert en utilisant de l'éthanol et mon transfert est correct. Par contre, lorsque j'utilise le méthanol, mon transfert est partiel alors que théoriquement le méthanol convient aussi bien.Je me demandais pourquoi (j'utilise de la nitrocellulose).  [...] Par ailleurs, mes anticorps secondaires sont un peu vieillos mais néammoins congelés avec du glycérol. Mon signal final sur le film est faiblard. j'ai vérifié mon kit ECL et même employé celui d'un collègue. Mon anticorps secondaire peut-il être périmé à ce point en 2 ans Faut-il l'utiliser à l'obscurité comme ceratin le préconise bien que d'ordinaire il marchait même à la lumière.   [...]