• Santé - Tampon, Température, Hybridation

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

Biologie moléculaire - Stringence

Je ne comprends pas très bien la différence entre une hybridation spécifique et une hybridation non spécifique dans le cadre de la complémentarité des bases dans l'ADN. Pourriez-vous m'éclairer s'il vous plait.  [...] En augmentant la stringence du tampon ou alors en augmentant la température utilisée lors de l'hybridation, on va sélectionner les hybridations entre les séquences qui ont un fort pourcentage d'identité. En effet, ces dernières pourront réaliser des interactions hydrogènes plus fortes sur l'ensemble de l'hybridation et donc l'hybridation sera plus stable dans un tampon stringent ou à haute température.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Je dispose d'ADN dans lequel je dois amplifier un gene particulier. Disons A. Apres plusieurs PCR je n'ai aucun resultat. Alors que quand je transfert cet ADN sur membrane et que je fais une hybridation, j'ai des signaux. Ma sonde est le gene que je cherche mais amplifie avec un control positif.  [...] Ensuite tu peux ajuster ta PCR. nb de cycles, faire un gradient de temperature pour l'hybridation, augmenter ou diminuer le temps d'élongation en fonction de la taille de ton fragment à amplifier, modifier ton tampon de reaction.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR "long range" sur des produits de Revrse transcription, possible ?

Je suis en train d'essayer de mettre au point une PCR pour amplifier un fragment de 5kb à partir de produits de reverse transcription (superscript 1 invitrogen avec random primer) dans le but de cloner cet amplicon dans un plasmide.   [...] J'ai a peu près tout changé. température d'hybridation, taq (maintenant je suis en Phusion, NEB), DMSO, tampon GC rich, et même le produit de RT (j'ai fini par tester la PCR sur des produits de RT vendus par roche) mais rien n'a fonctionné.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR qui veut pas marcher

D'après la publication il n'y a que 2 couples d'amorce qui ont la même température d'hybridation à 59°C et l'autre elle serai à 58°C. Je pense que sa n'influence pas trop.  [...] Après plusieurs PCR, je n'avais plus de produit pour mon mix et j'ai du donc en changer. J'ai changé le MgCl2, le dNTP et le tampon. J'ai du aussi utiliser un autre thermocycleur en gardant le même protocole. Apparemment les température d'hybridation n'était pas en cause.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Pour le clonage 1. oui j'ai testé over night, pendant 1h, 20 min (avec le tampon 2X ultra rapide soit disant)... pour la durée, j'ai tout testé. Les enzymes ne me paraissent pas trop rares, surtout XhoI avec laquelle j'ai déjà fait un clonage.  [...] Pour le clonage 2. SmaI oui je l'utilise à température ambiante (soit 25°C à peu près) et seulement après je rajoute l'autre enzyme à 37°C.  [...]

[Biochimie] Tampon phospate

Pourquoi faut-il conserver un tampon phosphate à ph 7 et à température ambiante.  [...]

[Biologie Moléculaire] marquage à la digoxigènine

JE cherche à savoir la composition du tampon d'hybridation. Sur le site de roche il me conseil d'utiliser le leur ce qui est commercialement normal et il me donne 3 compositions différentes.  [...] Tampon 1. High SDS buffer avec. 7% SDS. 50% formamide deionized. 5x SSC. 2% Blocking Reagent. 0,1% (w/v) N-lauroylsarcosine. 50mM Sodium phosphate, pH 7.0.  [...]

Hybridation in situ

Enfin tu laves à EtOH 70° tu centrifuges une dernière fois, tu vides, tu seches et tu reprends dans 100 ou 200 microL de tampon d'hybridation en fonction du gel que tu auras fais un peu plus tôt.  [...] Ben parce que le principe c'est d'hybrider des ARNs... la sonde est une sonde ARN antisens à l'ARN natif présent sur les coupes et que tu cherches à réveler.   [...]

[Biologie Moléculaire] In situ d'oursin et sonde ARN

j'ai donc recommencé avec les sondes ARN des gènes à tester ainsi que mon contrôle positif mais je n'obtient aucune coloration même pour le contrôle +.   [...] si quelqu'un ici à une idée je l'a testerai avec joie. Je pensais peut être ajouter une étape de digestion par une protéinase K avant de placer mes embryons dans le tampon d'hybridation. Vous en pensez quoi.  [...]