• Santé - Tampon, Température, Hybridation

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR "long range" sur des produits de Revrse transcription, possible ?

Je suis en train d'essayer de mettre au point une PCR pour amplifier un fragment de 5kb à partir de produits de reverse transcription (superscript 1 invitrogen avec random primer) dans le but de cloner cet amplicon dans un plasmide.   [...] J'ai a peu près tout changé. température d'hybridation, taq (maintenant je suis en Phusion, NEB), DMSO, tampon GC rich, et même le produit de RT (j'ai fini par tester la PCR sur des produits de RT vendus par roche) mais rien n'a fonctionné.  [...]

Biologie moléculaire - Stringence

Je ne comprends pas très bien la différence entre une hybridation spécifique et une hybridation non spécifique dans le cadre de la complémentarité des bases dans l'ADN. Pourriez-vous m'éclairer s'il vous plait.  [...] En augmentant la stringence du tampon ou alors en augmentant la température utilisée lors de l'hybridation, on va sélectionner les hybridations entre les séquences qui ont un fort pourcentage d'identité. En effet, ces dernières pourront réaliser des interactions hydrogènes plus fortes sur l'ensemble de l'hybridation et donc l'hybridation sera plus stable dans un tampon stringent ou à haute température.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR qui veut pas marcher

D'après la publication il n'y a que 2 couples d'amorce qui ont la même température d'hybridation à 59°C et l'autre elle serai à 58°C. Je pense que sa n'influence pas trop.  [...] Après plusieurs PCR, je n'avais plus de produit pour mon mix et j'ai du donc en changer. J'ai changé le MgCl2, le dNTP et le tampon. J'ai du aussi utiliser un autre thermocycleur en gardant le même protocole. Apparemment les température d'hybridation n'était pas en cause.  [...]

[Biologie Moléculaire] probleme avec ma PCR

Je dispose d'ADN dans lequel je dois amplifier un gene particulier. Disons A. Apres plusieurs PCR je n'ai aucun resultat. Alors que quand je transfert cet ADN sur membrane et que je fais une hybridation, j'ai des signaux. Ma sonde est le gene que je cherche mais amplifie avec un control positif.  [...] Ensuite tu peux ajuster ta PCR. nb de cycles, faire un gradient de temperature pour l'hybridation, augmenter ou diminuer le temps d'élongation en fonction de la taille de ton fragment à amplifier, modifier ton tampon de reaction.  [...]

températures et PCR

Je comprends bien qu'il faut une forte température pour dénaturer les GC mais du coup il faudrait une température d'hybridation faible non Donc je me suis trompée.  [...] Pour que tes amorces puissent s'hybrider à la matrice d'ADN, il faut que celle-ci sois dénaturée pour permettre l'accessibilité des amorces. Ainsi à Tm-5°C on considère que l'hybridation peut se faire correctement. Et oui, le Tm est la température à laquelle tu as 50% de ton ADN sous forme simple brin (et donc 50% en double brin).  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR : bandes aspécifique et température

J'ai commencé avec une température d'hybridation volontairement inférieur à celle du Tm de mes amorces car j'ai amplifié un autre insert dans le même programme de PCR.  [...] Comme cette fois je n'avais qu'un seul produit à amplifier j'en ai profité pour augmenter ma température hybridation afin d'être plus proche des Tm de mes amorces.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème amorce PCR

Ben vu tes Tm il faut faire une hybridation à basse température (on conseille en générale 5°C en dessous du Tm théorique). Mais a 40°C ton oligo de Tm 60° va s'hybrider spécifiquement n'importe ou.  [...] Le problème c'est que plus du augmente la température d'hybridation, moins ton amorce 44°C va s'hybrider, voir plus du tout. Je pense qu'il faut que tu la refasse, voir refaire tout le couple pour avoir deux Tm proches.  [...]

[Biologie Moléculaire] Besoin explication température d'hybridation

pourtant la température d'hybridation utilisée dans le thermocycleur varie de 59 à 45 °C (intervalle de 1 °C a chaque cycle), alors que j'aurais pensé qu'il fallais une Ta de 63°C.  [...] En PCR on cherche à ce que le maximum d'amorces soient hybridées (dans l'idéal 100%). Alors on se place générallement 5°C (voir plus) en dessous du Tm (c'est la température d'annealing ou Ta).  [...]

Température d'hybridation et PCR

je connais pas ta formule pour determiner le tm d'une amorce mais tellements de parametre rentrent en jeux dans l'hybridation d'un oligo pendant ta PCR qu'en general pour etre sur de son coup on enleve 5° à la temperature que l'on a calculé.  [...] La réponse est simple, il suffit de savoir ce qu'est... theoriquement... le Tm. Le Tm est la température à laquelle statistiquement, il n'y a que la moitié des liaisons des appariements qui sont formés. Et la moitié, c'est bien insuffisant pour un hybridation d'amorce.  [...]