• Santé - Tampon, Protéines, Western

western-blot

je suis entrain de faire des western sur des mutants afin de voir la différence d expression d une protéine dans ces lignees. Or je suis obligé pour cela de précipiter mes protéines sinon je n ai pas les quantites suffisantes.  [...] Je fais également des western blot et j'ai le même problème que toi. je resuspend mes protéines directement dans le tampon de charge donc je ne peux pas quantifier la quantité de protéines que je dépose sur gel.  [...]

[Biochimie] tampon de lyse

juste une petite question, je travaille sur des cellules 293-t et lorsque je lyse certaines protéines restent insolubles, quelqu'un aurait-il une idée pour un tampon amélioré qui me permettrait de solubiliser ces protéines en vu du western.  [...] les protéines membranaires sont très difficiles à solubiliser. Peut être pourriez-vous tenter de le solubiliser dans de l'urée/thiourée si ce n'est pas incompatible avec votre western.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

En fait quand on fait un western, on part du principe que pour des proteines de taille standard, si elle ne sont plus dans le gel apres transfert et coloration au bleu de coomassie, alors elles sont sur la membrane. Ceci est vrai si la polarité a été respectée durant le transfert, sinon les protéines sont dans le tampon et pas sur la membrane (mais dans ce cas, ce sont toutes les protéines).  [...] La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.  [...]

[Biochimie] Paramètres western blot

Je fais beaucoup de western sur des proteines de 150 et 155Kda. J'utilise un gel 4-12% bis-tris precast (NuPage Novex bis-tris). Je migre dans du tampon MOPS (je te laisse regarder sur le site fournisseur la compo) et ca me donne une super resolution.  [...] Mais si tu n'as que ces deux protéines à regarder, n'hésites pas à faire sortir des bandes de l'ordre de 100 kDa, tes deux formes seront d'autant mieux séparées.  [...]

[Divers] Probleme western blot!!

Bonjour, depuis quelques temps j'ai un problème avec mes western, il n'y a pas de proteine de haut poids moléculaire. pourtant comme vous pouvez le voir il ne s'agit pas d'un problème de transfert car certain échantillon ainsi que le marqueur ont des proteines de haut poids.  [...] La c'était 75ug mais ca me le fait a 50 et 100ug de proteines. les échantillons n'ont pas était chauffé. Ils ont juste était préparé le jour précédent le western (lammly buffer ajouté) et congelé, gel préparé également le jour d'avant (mis au frigo dans su tampon d'éléctrophorèse).  [...]

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Je cherche le moyen d'optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire. Je travaille sur FAS (274kDa) et je n'arrive pas à la transférer.  [...] Il n'y a pas de tampon de transfert étant donné que c'est un transfert à sec. Une fois que ton gel a migré, tu utilises un appareil spécial pour cela et en quelques minutes, c'est transféré. Ca revient un peu plus cher que la méthode classique (7 à 8 euros par transfert de mémoire) mais pour les grosses protéines ça marche largement mieux.  [...]

[Génétique] Western blot

Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge.  [...] Le dosage protéique a été effectué correctement. Je dois soumettre mes échantillons a différentes conditions (avec et sans inhibiteur) pour voir l'abondance d'expression des mes protéines selon la condition adéquate, donc il est impératif que la tubuline soit intacte pour tout mes puits pour que je puisse quantifier.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...] Je me demande si c'est possible que avec le Temps et le voltage que tu mets, tes protéines ne passeraient pas au travers de ta membrane pour se retrouver dans le tampons moux ( je sais plus le nom) en dessous de ta membrane.  [...]

[Biochimie] Interaction cellule-protéine après précipitation (Western Blot)

Me disant que finalement mon problème serait un western moche avec un trop plein de matériel je fais comme si de rien n'était et continue.  [...] Je me demande donc si éventuellement le fait d'avoir précipité le matériel cellulaire ainsi que les protéines provoque certaine interaction ou quelque chose du genre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

je dois doser par Western blot les proteines suivantes.Fatty acid synthase ( FASN) et les proteins. Insulin receptor, Phospho Insulin receptor.  [...] Pour les extraits, j'utilise ce protocole sur du foie et sur des cellules, ça revient au même. Il faut faire attention a ne pas mettre trop de tissu dans le tampon, l'idéal étant de peser environ 30mg pour voir ce que ça fait. Grosso modo, une tete d'allumette dans 500µL et tu as de quoi faire des centaines de western.  [...]