• Santé - Tampon, Phosphate, Résine

[Immunologie] Immunoprecpitation: liaison de la resine protG avec l'anticorps qui marche pas

Bonjour tous le monde. Je suis entrain de faire la mise au point d'une IP. pour se faire j'ai voulu juste tester le rendement de la résine protG avec l'anticorps sans rajouter la protéine d'intérêt. la résine ne capte même pas le 1/10 de la quantité de l'anticorps de départ qui est de 1µg dans 500µl de PBS avec 50µl de la résine.  [...] C'est peut-être à cause des charges Avez-vous essayé de laver au tampon Tris-EDTA ou phosphate sans NaCl Quelle résine utilisez-vous.  [...]

[enzymologie] Activité enzymatique et flux

Pour la PFK, tout ce que j'ai trouvé est de mesurer la disparition de NADH en couplant l'enzyme à l'aldolase, la glycerophosphate deshydrogenase (pquoi celle ci, jl'ai pas compris..) et la triose phosphate isomerase.  [...] Ensuite, on va pouvoir déposer cette résine dans une colonne dont la sortie est protégée par un tampon (coton fritté, des trucs comme ça...), que l'on va équilibrer avec le tampon de l'enzyme (Tris en gardant le même exemple).  [...]

Séparation par chromatographie sur résine échangeuse de cation

Voilà, j'ai un exo à faire, mais le problème est que je n'arrive pas à trouver un site qui puisse m'aider. On me demande d'indiquer et justifier l'ordre d'élution de trois acides aminés lorsque le tampon varie de 3 à 10. Est ce que je me trompe en pensant qu'il y a un rapport entre le pH du milieu et le pHi des AA.  [...] Non, tu n'as pas tort, regarde la charge des AA à chaque pH de tampon. d'un autre coté, 'as la charge de la résine et donc (même chage que la résine=répulsion de l'AA=élué en premier), charge opposée=élué en dernier.  [...]

[Biochimie] B-Galactosidase d'origine vegetale

1- Pour l'extraction, j'ai fait bcp de recherche puis j'ai constate que le tampon d'extraction le plus utilise est le NaOAc avec du mercaptoethanol. Comment savoir le %, la concentration de mon tampon.  [...] 3- Par la suite, pour les etapes de chromato. Je vais utiliser une chromato d'echangeur d'ions CM-Bio gel suivi d'une second chromatographie cette fois ci d'affinite (Lactosyl Sepharose). Comment savoir quoi utiliser. le tampon, la quantite de resine,la quantite d'echantillon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ADN génomique

Autrement dit, pourquoi ne pas dissoudre son ADN dans de l'eau, histoire d'éviter les problèmes lié au tampon (vieillissement, oxydation, dégradation, pH modifié...etc.).  [...] Je me suis posé la même question en première lecture mais après coup je me suis dis que ce n'était pas du TE textbook dont il était question mais la solution TE du kit. En général les kit ont un tampon d'elution spécial pour leur résine et qui est optimisé pour pouvoir faire ses prep derrière.  [...]

[Biochimie] exercice de chromatographie pour un peptide

On prend un autre lot de P qui est aussi traite par la trypsine. Les 4 mm peptides st séparés par chromatographie sur gel d'exclusion. Puis ceux ci st soumis à une hydrolyse totale. Chaque hydrolisat est analysée sur une résine de polystyréne sulfoné échangeuse de cations (pH CROISSANT), ainsi on obtient quatre peptides a, b, c et d.  [...] On part avec un tampon acide (pH=1-2). On a alors tous les aa chargés +. Ils sont donc liés à la phase stationnaire. A mesure que l'on augmente le pH, les aa vont se deprotonner. Lorsque l'aa sera neutre electriquement, il n'interagira plus avec la résine et sera élué.  [...]

[Biologie Moléculaire] Aide pour devoir sur chromatographie

Il faut bien que tu comprenne le principe d'une résine échangeuse d'ions et tu pourra répondre a toutes les question suivante.  [...] Merci de ta réponse. La résine IRC amberlite 50 est une résine carboxylique cationique faible. Le problème c'est que nous sommes que en 1ère et j'ai l'impression que c'est un TP de terminal voir de BTS.  [...]

[Biochimie] Quelle résine Nickel pour purifier mes protéines?

Quelle résine Nickel utilisez-vous pour purifier vos protéines taggées His6.  [...] Ta pas que cette étape de purification pour ta prot de toute façon j'imagine Sinon une ionique et une GF derrière et ta prot sera 100% pure.   [...]

dégradation de protéine recombinante

Si tu n'as pas accès à une FPLC ou HPLC, le mieux est de tenter une échangeuse d'ion. Vu la différence de taille entre ta protéine et les deux fragments, il y a de bonnes chances pour que leurs pI soient suffisamment éloignés pour que ça marche. Il existe des colonnes jetables en plastique (biorad), tu achetes de la resine (DEAE pour echangeuse d'anions, phosphocellulose pour echangeuse de cations) et tu peux faire des manipes pour des années.  [...] Tu peux aussi faire un SDS-PAGE sur un extrait de résine incubée avec ton extraction protéique (sans laver), ça te dirais si les contaminants apparaissent au moment des lavages, à cause des protéases ou avant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification Protéines Tag 6His

Sinon le problème en batch, contrairement aux purifs sur colonne, c'est que les autres protéines qui ne se fixent pas sur la résine restent en permanence en contact avec ta prot, ce qui augmente les risques de protéolyse. Et 4 heures, je trouve ça très long quand même.  [...] Combien de temps dure ta purif au total, et chacune de tes étapes La protéine restée sur la résine aura passé plus de temps que celle non fixée dans le support où tu fais ta manip, donc là encore, elle a plus de chance d'être dégradée. Surtout si parmi les autres protéines également fixées (est-ce qu'il y en a d'autres d'ailleurs ) il y a des protéases (qui en se fixant deviennent plus concentrées que dans ton lysat...).  [...]