• Santé - Tampon, Hybridation, Sonde

[Biologie Moléculaire] marquage à la digoxigènine

JE cherche à savoir la composition du tampon d'hybridation. Sur le site de roche il me conseil d'utiliser le leur ce qui est commercialement normal et il me donne 3 compositions différentes.  [...] Tampon 1. High SDS buffer avec. 7% SDS. 50% formamide deionized. 5x SSC. 2% Blocking Reagent. 0,1% (w/v) N-lauroylsarcosine. 50mM Sodium phosphate, pH 7.0.  [...]

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

[Biologie Moléculaire] Réalisation d'un Southern Blot

Voila, j'ai réalisé pour la première fois il y a environ 1 mois un southern blot mais certaine choses sont encore un peu floue pour moi. Ainsi, pourquoi lors de la préhybridation et de l'hybridation utilise ton du SDS qui est un détergeant anionique.  [...] Le SDS joue entre autres le role d'un agent mouillant qui va permettre aux differents constituants du tampon (de préhybridation, d'hybridation) d'atteindre la membrane. Dans un Southern blot l'hybridation entre la cible et la sonde n'est pas libre comme dans une solution car l'ADN cible est fixée à la membrane de nylon et il y a une interaction complexe à l'interface entre une membrane solide et un liquide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation ADNc / ADNg : besoin de confirmer !

Jusque là tout vas bien. sur notre ADNg. on a bien deux sites de restrictions adjacents HindIII qui donnent un fragment de 0,3Kb et qui hybrident avec ma sonde H.  [...] Or notre sonde N d'ADNc de 1Kb (je rappelle NcoI/NcoI) ne possède pas de site de restriction pour HindIII donc il existe un site de restriction pour HindIII dans l'intron de 0,8Kb.  [...]

[Biologie Moléculaire] signal southern blot

J'ai essayé plusieurs chose, changer les kits de marquages ( digoxygenine ), resynthétiser une sonde, changer de fournisseur, refaire tout les tampons, changer les températures d'hybridation... rien de mieu.  [...] Il y a quelques semaines j'ai coupé ma membrane en deux, j'ai hybridé la premiere partie avec un ancien tampon+sonde avec lequel j'avais obtenu de bon résultat.. et la deuxieme moitié avec le tampon et les sondes que j'utilise ces derniers moi.  [...]

[Microbiologie] Hybridation Southern Blot

Vous parlez d'hybridation avec la sonde C'est le principe clef de cette technique. on crée une sonde taggée (avec un radio-isotope ou un fluorophore) qui cible la séquence d'intérêt. La sonde s'hybride avec la séquence cible, on lave le gel de l'excédent de sondes, puis on redarde où s'est hybrider la sonde relativement sur le gel.  [...] a) S'il s'agit d'une variation génétique/ allélique d'un gène séquencé, en designant la sonde selon le gène sauvage, vous aurez tout de même une hybridation hétéroduplex (incomplète/imparfaite), mais pour une détection par SB ça devrait suffir.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation d'une sonde nucléique plasmidique

[Biologie Moléculaire] Hybridation d'une sonde nucléique plasmidique.  [...] Voila j'ai un petit probleme lors d'un TP sur l'hybridation d'une sonde nucléique plasmidique non radioactive sur colonies bactériennes on me demande la nature et le role des dépôts d'ADN génomique et ADN plasmidique.  [...]

[Génétique] Sondes de Southern Blot et complémentation

Il était effectivement implicite dans ma réponse que je ne considère qu'un fragment d'ADNc comme sonde, de façon à hybrider une séquence qui correspond à un exon (éviter qu'elle soit à cheval entre deux exons et donc pas hybridable à l'ADNg).  [...] En moyenne, il me semble qu'une sonde fait 100 à quelques centaines de nucléotides de longueur. Si tu veux détecter la présence d'un gène qui fait 3000 kb, avec un ADNc qui ferait par exemple 2000 nt, c'est bien trop long. Réduire la taille te permet une meilleure hybridation... et d'être intraexonique.  [...]

[Biologie Moléculaire] In situ d'oursin et sonde ARN

j'ai donc recommencé avec les sondes ARN des gènes à tester ainsi que mon contrôle positif mais je n'obtient aucune coloration même pour le contrôle +.  [...] si quelqu'un ici à une idée je l'a testerai avec joie. Je pensais peut être ajouter une étape de digestion par une protéinase K avant de placer mes embryons dans le tampon d'hybridation. Vous en pensez quoi.  [...]

Hybridation in situ

Enfin tu laves à EtOH 70° tu centrifuges une dernière fois, tu vides, tu seches et tu reprends dans 100 ou 200 microL de tampon d'hybridation en fonction du gel que tu auras fais un peu plus tôt.  [...] Ben parce que le principe c'est d'hybrider des ARNs... la sonde est une sonde ARN antisens à l'ARN natif présent sur les coupes et que tu cherches à réveler.  [...]