• Santé - Tampon, Cellules, Enzyme

[Biologie Moléculaire] Insoluble au NP40??

J'étudie l'intéraction entre une kinase et un substrat potentiel. Lorsque j'essaye une IP sur mes cellules, la molécule supposé substrat devient insoluble au tampon de lyse alors qu'elle ne l'est pas quand les cellules ne sont pas cotransfectée avec l'enzyme.  [...] Quand je fais un blot sur le culot je ne vois la protéine (substrat) en fragment. Que dois en conclure Une éventuelle phosphorylation peutêlle rendre le substrat insoluble au np40.   [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Après une centrifugation à 400 g pendant 10 minutes à 4°C, les granulocytes sont remis en suspension dans le tampon de lyse de chromatographie (cf. annexe 1) à la concentration de 50.10 6 cellules/ml et à raison de 25.10 6 cellules par tube. Les cellules sont lysées par sonication, à raison 6 fois 5 secondes en prenant garde à bien refroidir les tubes entre chacune des phases de sonication pour éviter une dénaturation trop importante de l'enzyme.  [...] Les cellules sont remises en suspension dans le tampon de lyse pour western blot (cf. annexe 1) à la concentration de 50.10 6 cellules /ml. Elles sont soniquées 6 fois 5 secondes, en refroidissant les tubes entre chaque passage. Les milieux sont centrifugés à 8000 g pendant 5 minutes à 4°C pour éliminer les noyaux et les cellules non lysées.  [...]

[Microbiologie] digestion de plasmide

j'ai digéré mon plasmide pbluescript avec ECOR I le problème c'est que je me suis rendue compte après que le tampon OPA seul avec le plasmide sans Enzyme provoque une digestion de ce dernier donc le tampon contient des endonucléases sachant que je ne peux pas jeter le tampon parce que sinon je dois patienter 3 mois pour recevoir la prochaine commande une dilution de tampon serait elle efficace pour se débarrasser des nucléases Même si je sais que ce n'est pas la bonne solution.  [...] Si dans le tampon que tu as utilisé y a des nucléases, tu peux balancer ta restriction que tu as faites (car ton ADN est coupé dans tous les sens) et la refaire avec un tampon plus adapté. Si je me trompe pas, un bête tampon H fera l'affaire pour une digestion EcoRI de pBluescript (le tampon est fourni avec l'enzyme).  [...]

[Biologie Moléculaire] électrophorèse en champ pulsé

est ce que j'ai un problème au niveau de la préparation de plug ( pas d'ADN ) ou bien problème au niveau de l'enzyme que j'ai utilisé.  [...] je ne sais pas est ce que c'est probléme d'enzyme condition d'incubation ou pas bien mélanger ou il n y a pas d'ADN déjà (plugs mal préparé) vraiment j'ai peur que ca soit question d'ADN a votre avis la fluorescance qui est dans les puits ca correspond a quoi et pkoi a votre avis il n y a pas de migration.  [...]

[Biochimie] PCR: a quoi servent les differents elements

*Le tampon, c'est pour le bon fonctionnement de l'enzyme. il lui faut un pH particulier qui ne doit pas évoluer au court de la réaction. Or, les dNTP et l'ADN n'ont certainement pas les mêmes propriétés acidobasiques. d'où l'utilisation du tampon.  [...] je vais trancher. pour le MgCl2, c'est un cation divalent nécessaire à l'activité de nombreuses enzymes dont la Taq, mais il peut aussi jouer en tant que sel dans la température d'hybridation. Pour le DMSO c'est en effet pour éviter les structures II dans l'ADN.  [...]

[enzymologie] Activité enzymatique et flux

Pour cela on va chauffer l'enzyme en la mélangeant à une résine qui se liquéfie à une température de 40-42°, on applique le mélange dans une burette chaude et on fait goutter la burette dans le tampon initial de l'enzyme (Tris par exemple) à tempréature ambiante ou même plus froid.  [...] Ensuite, on va pouvoir déposer cette résine dans une colonne dont la sortie est protégée par un tampon (coton fritté, des trucs comme ça...), que l'on va équilibrer avec le tampon de l'enzyme (Tris en gardant le même exemple).  [...]

[Biologie Cellulaire] PCR et électrophorèse

Je réalise pour la première fois une PCR et une électrophorèse qui va avec et on me demande pourquoi le tampon de la Taq est-il coloré en vert et quel est l'avantage J'ai bien compris que le tampon était indispensable au bon fonctionnement de l'enzyme, mais je ne comprend pas bien l'histoire de la couleur Pour permettre une fluorescence et donc une révélation à l'électrophorèse.  [...] Vous mélangez deux choses. il faut traditionnellement un tampon de réaction, qui permet le fonctionnement de l'enzyme, et un tampon de dépôt, qui permet de stabiliser l'ADN et de déposer l'échantillon dans le puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème : oublié centri sur cellules dans tampon de lyse => WB????

j'ai essayé de résumer mon pb dans le titre. En fait j'ai mis mes cellules adhérentes dans du tampon de lyse pour immunoprécipitation, mais j'ai oublié la centrifugation et je n'ai donc pas récupérer les membranes et noyaux. Donc là j'ai ajouté mon sample buffer mais biensur j'ai ma fraction qui est trop visqueuse pour être déposée en blot. que dois je faire pour pouvoir déposer.  [...] D'autre part, la viscosité peut-être éliminée en chauffant. ce qui rend l'extrait visqueux c'est le DNA essentiellement. Après le problème peut aussi venir de la quantité de cellules que tu as lysé.  [...]

[Biologie Moléculaire] extraction d'ADN plasmidique

Sinon pour les bactéries classiquement utilisées en labo de bio mol (E. coli principalement), de nombreux kits d'extraction de plasmides existent sous les noms mini- (environ 100 mL de culture bactérienne), midi- (250 mL de culture), maxi- (500 mL) ou mega-prep (1L et plus) et sont fournis par des compagnies comme Qiagen.   [...] Digestion enzymatique de la paroi et/ou lyse mécanique des cellules (par exemple avec des micro billes en ver dans un tube que tu vortex en présence des cellules bactériennes). Il faut procéder à cette lyse dans un tampon de lyse contenant notamment de l'EDTA pour protéger le matériel génétique des DNAses et éventuellement des dénaturant protéiques tel que le SDS et le béta-mercaptoéthanol.  [...]

[Génétique] hybridation adn/adn : technique de southern blot

- contaminaton des échantillons (je précise que les cones n'ont pas été changés), mais je ne vois pas en quoi cela expliquerait la faible migration. A moins que dans ce cas là, la présence simultanée de plusieurs enzymes aurait engendré des fragments vraiments minuscules, ce qui expliquerait que ceux ci soit sortis du gel.  [...] Par contre je n'ai pas bien compris le rôle du tampon 10x. S'agit-il bien d'un tampon permettant l'activation de l'enzyme en question Dans ce cas, une quantité insuffisante de ce tampon expliquerait - il une digestion incomplète de l'enzyme, d'où le fait que j'obtienne des fragments trop gros restant coincés en haut du gel comme tu l'as dit.  [...]