• Santé - Tag, Expression, Protéine

RT PCR et après ....

J'ai réalisé à cet effet une RT-PCR suivie d'une PCR, après avoir fait un gel d'agarose, faut-il que je fasse autre chose pour pousser plus avant cette inspection de l'expression de mon gène.  [...] J'oubliais de dire, qu'une autre facon de tester l'expression de ton gene, est de verifier la presence de la proteine par western blot. en comparant cela avec les proteine d'une cellule non transfectee. Cela necessite, cependant, d'avoir des anticorps contre ta proteine, ou d'avoir ajouter un tag a ta proteine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Dans le cadre de mon travail de thèse j'étudie l'expression d'une protéine. Pour commencer j'ai donc cloner le cDNA dans un vecteur d'expression pCDNA3 afin de le transfecter dans des HEK. Malheureusement il n'existe qu'un seul type d'anticorps contre cette protéine et le seul qui existe ne fonctionne absolument pas.  [...] * Shuttle insert DNA from one expression vector to another affords flexibility while simplifying your cloning workflow.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

.. J'ai décidé de rester chez coli parce que les essais préliminaires d'expression de cette protéine mais avec un tag MBP (j'utilise hexa-His) ont été concluants.  [...] 107 kDa, c'est très gros pour une expression en bactérie. Parfois ça marche mais en général ça finit en corps d'inclusion ou en protéine non exprimée. Le passage en baculovirus me semble inévitable dans ton cas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfection Huv-ec-c

Sinon question completement idiote, mais bon. C'est un plasmide GFP, j'imagine que vous testez l'expression en GFP. Vous êtes certain que le plasmide est bon Parce que si vous cassez la phase de lecture il n'y a pas de GFP.  [...] - Pour l'expression de la GFP, j'ai testé ces mêmes constructions dans un autre type cellulaire (Huh7, que je connais mieux et pour lesquelles je n'ai jamais eu de problème de transfection) et la protéine s'exprime bien avec son tag GFP.  [...]

[Biochimie] enzymes et substrat biolux

la GFP c'est encore autre chose. Elle n'a pas d'activité enzymatique contrairement a la ßgal ou luciferase. C'est simplement une protéine fluorescente, c'est à dire qu'elle émet des photons lorsqu'on l'excite a une longueur d'onde particulière. Elle n'utilise pas de substrat au sens chimique.  [...] Elle n'est pas utilisée comme rapporteur de la même façon que la beta gal. A ma connaissance, la GFP n'est pas utilisée de façon quantitative à la différence des autres rapporteurs cités. Elle est par contre fortement utilisée comme tag ou comme transgène pour témoigner de l'expression d'un gène ou de la présence d'une protéine de façon qualitative (spatio temporel).  [...]

[Biologie Moléculaire] rrnB plasmide pMALc2x

Petite question de biologie moléculaire, j'ai ajouté mon gène d'intérêt dans le vecteur pMALc2x afin de produire ma protéine avec le tag MBP. Le promoteur est le promoteur tac inducible par IPTG pas de problème, mais à quoi correspondent les régions rrnB ce serait des terminateurs, mais pourquoi je ne les ai jamais vu sur les autres vecteurs d'expression type pET par exemple et surtout qu'est ce que cela apporte de plus, pourquoi avoir choisit un terminateur qui se compose de 2 régions.  [...]

[Biochimie] Séquence Kozak

Je vais donc en mettre une aussi devant la séquence codant pour le tag.Ma question. est-ce qu'il faut supprimer la séquence Kozak devant l'atg de la protéine pour ne plus avoir que celui en tête du tag ou cela n'a-t-il pas d'importance.  [...] En théorie si on met une séquence avant et une séquence après le tag (avant la protéine) il est possible que l'initiation de la traduction commence avant le tag (s'il a bien un ATG...) et aussi avant la protéine (après le tag).  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Tous les binome n ont pas utilisé les mm vecteurs et systemes d expression, mais certains ayant aussi utilisé un systeme comportant le plasmide pLysS (contenant l adn codant pour le lysozyme) detectent aussi une bande intense correspondant au lysozyme...bref, le soucis c est que je n arrive pas a l expliquer.-s.  [...] Les résultats de l'expression puis de la purif ne sont pas toujours très bon avec un HisTag (et en général moins bon qu'avec un autre Tag). Les His sont chargées + et cela peut gêner la structure de la protéine puis sa stabilité. De plus en interagissant avec la protéine il peut ne pas être accessible pour la purification.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine étiquetée

C'est une protéine où on va lui coller une séquence Tag (exemple, l'histidine) et ça permet de savoir quel dose de protéines exogènes tu utilise dans ta culture cellulaire.  [...] Le tag est une séquence d'acides aminés rajoutés en amont ou en aval de ta protéine et permet de la visualiser (tags fluos) ou de la purifier (his tag, gst tag...).  [...]

Créer une protéine taguée NLS

Ma question est. comment lui ajouter très simplement un tag NLS pour avoir une protéine constitutivement nucléaire.  [...] Quelqu'un connait-il un vecteur avec un tag NLS dans lequel je pourrai rentrer la séquence codant ma protéine Puis-je acheter directement le TAG.  [...]