• Santé - Site, Restriction, Vecteur

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Génétique] les vecteurs

s'il vous plait est ce que le site de restriction (au niveau du vecteur) = site d'insertion d'une séquence d'un gene (resistant à l'antibiotique par expl).  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

il faut couper le vecteurs par un enzyme de restriction ensuite il faut inserer les meme sites de restriction autour de la sequence d'adn qu'on veut afin qu'on integre la sequence dans le vecteur.  [...] J'ai moi aussi de la difficulté a trouver un vecteur approprié, Et Je ne comprend pas pourquoi le bon vecteur dans cet exemple serait PinPoint xa-1 Selon ce que j'ai vu il ne possede pas de sites de restriction communs avec la sequence d'ADNc dans sa region du gene de resistance Je ne comprend pas d'ailleurs pk le site de restriction doit se trouver dans la sequence de resistance a l'antibiotique et non ailleurs dans le plasmide.  [...]

transgénèse végétale

Dois-je prendre des primers qui ont un site de restriction bien spécifique pour pouvoir mettre l'ADN amplifié dans le vecteur ti désarmé après Quel doit être la longueur du primer environ.  [...] Le promoteur 35S faut-il que je le clone aussi dans le vecteur ou est il généralement déjà dans les plasmide ti désarmé avec un site polylinker Si quelqu'un connait un site ou il y a un schéma ce serait super.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options. soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital. les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE.  [...] Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ( multi cloning site ) entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] Le problème est qu'après PCR j'obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d'hybridation, différentes TAQ… j'ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j'ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

L'objectif de ce clonage est de récupérer une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp.  [...] Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500¬, c'est vraiment rien. Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.  [...]