• Santé - Site, Restriction, Vecteur

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Génétique] les vecteurs

s'il vous plait est ce que le site de restriction (au niveau du vecteur) = site d'insertion d'une séquence d'un gene (resistant à l'antibiotique par expl).  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs de clonage

Vous devez pouvoir produire la protéine, ce qui signifie que la séquence codante va être transcrite et traduite. Le traduction va s'opérer grâce à la machinerie bactérienne, pas de souci. En revanche, la transcription va nécessiter la présence d'un promoteur sur le vecteur, c'est la première chose que vous devez chercher.  [...] Ceux qui n'en ont pas sont à éliminer. Ensuite, il faudra que vous verifiez 1. qu'un des sites de restriction de la cassette de clonage peut être utilisé (le site de restriction ne se trouve pas dans votre séquence codante), et 2. que ce site permet un clonage en phase avec un éventuel start de transcription présent sur le vecteur (vérifier aussi si il y en a un ou pas d'ailleurs).  [...]

transgénèse végétale

Dois-je prendre des primers qui ont un site de restriction bien spécifique pour pouvoir mettre l'ADN amplifié dans le vecteur ti désarmé après Quel doit être la longueur du primer environ.  [...] Le promoteur 35S faut-il que je le clone aussi dans le vecteur ou est il généralement déjà dans les plasmide ti désarmé avec un site polylinker Si quelqu'un connait un site ou il y a un schéma ce serait super.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options. soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital. les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE.  [...] Je ne sais pas quel vecteur tu veux utiliser, mais il existe des centaines de vecteurs commerciaux qui comportent tout ce qu'il faut, dont un MCS ( multi cloning site ) entre le promoteur et le terminateur. Ce site contient une grande quantité de sites de restriction et permet d'insérer facilement ce que tu veux. (voir image).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...] Après la PCR, tu clives l'insert avec la ou les enzymes de restriction appropriées, idem pour le vecteur. Puis ligation insert/vecteur.  [...]

PCR problème de poids moléculaire

Alors voilà j'ai reçu un plasmide d'un collaborateur contenant une séquence qui m'intéresse. Je dois récupérer cette séquence pour la sous-cloner dans un autre vecteur. J'ai donc designé 2 primers contenant le début ou la fin de ma séquence + un site de restriction enzymatique.  [...] Le problème est qu'après PCR j'obtiens un fragment à environ 3500pb au lieu des 2300 attendues. Après avoir essayé différentes températures d'hybridation, différentes TAQ… j'ai fini par envoyer à séquencer et pas de problème la séquence voulue est bien là… donc j'ai designé de nouveaux primers car les premiers avaient un Tm très différent, et après PCR je retombe encore sur cette bande trop haute + une bande vers 750, comme avec les précédents primers.   [...]

[Biologie Moléculaire] Choisir le bon vecteur?

il faut couper le vecteurs par un enzyme de restriction ensuite il faut inserer les meme sites de restriction autour de la sequence d'adn qu'on veut afin qu'on integre la sequence dans le vecteur.  [...] Vous cherchez un vecteur qui va permettre d'exprimer votre protéine d'intérêt Sans même regarder la carte de restriction et s'y connaître même un minimum en biologie moléculaire, on peut lire ceci dans la première phrase des documents qui vous sont fournis pour chacun des vecteurs.  [...]