• Santé - Site, Restriction, Digestion

[Biochimie] Analyse résultats PCR - TPE

3. La mutation génère/détruit un site de restriction. Vous le voyez en procédant à une digestion de restriction effectuée sur un produit PCR bornant le site de mutation.  [...] 4. L'extrémité 3' d'une amorce doit absolument être complémentaire du fragment à amplifier faute de quoi l'ADN polymérase ne peut pas amorce la réplication. Vous ciblez pile l'extrémité 3' de votre amorce sur le site muté. La PCR ne fonctionne pas contrairement à la population générale.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] Une autre solution vient de me traverser l'esprit. faites une mutagénèse du site de restriction qui vous embête pour le flinguer.  [...]

Enzyme de restriction et activité étoile!

Sinon, pour s'assurer que tout les morceaux soit à bout franc, il suffit de rajouter une autre enzyme, comme la nucléase S1, par exemple (il y en a d'autre). Cela permet toujours de réaliser un clonage après purification et sélection du fragment désiré.   [...] Sinon, si l'objectif est de n'obtenir que des fragments à bouts cohésifs, c'est une autre paire de manche (pourquoi ne pas essayer une digestion partielle). Ou un clonage qui permettent d'insérer un site de restriction plus commun.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Pour ce qui est de l'insert... Je réalise une PCR avec primers modifiés, c'est à dire que j'ai ajouté le site de restriction à une extrémité du primer. Le produit de PCR a été cloné dans TOPO pour faciliter la digestion des extrémités (vérif par séquençage).  [...] En fait je digère avec XbaI (qui se liguera à SpeI en perdant le site de restriction donc) et avec SacII pour l'autre extrémité... Après digestion, extraction sur gel et purification, je procède à la ligation... et à mon avis le problème c'est ça.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

A la fin du catalogue NEB ou sur leur site, il donne le nombre de nucléotides qu'il faut avoir entre le bord et le site de restriction pour que la digestion se fasse de manière correcte.  [...] Le produit PCR est effectué à l'aide d'amorces dont le site de restriction a été rajouté avec 3 nucléotides en amont. Celui-ci a été purifié à l'aide d'un kit de purification de produit PCR sans passer par une extraction sur gel car j'ai un produit bien spécifique.  [...]

[Génétique] site de restriction HinfI

Dans le but de faire une digestion avec HinfI, je trouve toujours des fragments de tailles différentes de celles trouvées dans la littérature.  [...] D'apres mes recherches( Le résultat trouvé selon le site de restriction mapping. http.//www.restrictionmapper.org/cgi-bin/sitefind3.pl ), la digestion donne 2 fragments de 176 et 22, par contre dans tous les articles ils trouvent deux fragments de 175 et 23, soit un décalage d'une base.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

Pour qu'une bonne digestion se fasse sur un produit pcr, il faut généralement que ton site de restriction soit entouré de nucléotides de part et d'autre. Donc il ne faut pas juste rajouter ton site de restriction à ton primer, mais aussi des nucléotides supplémentaires.  [...] @malesore. une fois ton produit PCR obtenu, tu le purifies avant de digérer par les enzymes de restriction ou tu purifies après l'étape de digestion.  [...]

[Microbiologie] Exercice carte de restriction

Après j'ai regardé B+E. on remarque que les bandes de E et de B seules sont équivaut à B+E du coup je me suis dit que les sites de restrictions sont consécutifs, j'ai donc inséré EcoRI après le 2e site de B (en lisant dans le sens horaire) et l'autre E à 1300pb du 1er E (toujours en lisant dans le sens horaire) ce qui donne la seconde image.  [...] Qu'en pensez-vous sachant que le fragment d'intérêt (B1 B2) ne présente aucun site de restriction ce qui me paraît un peu bizarre (on ne peut pas vérifier si le fragment a bien été inséré sans digestion d'un site spécifique au fragment considéré).  [...]

[Biochimie] Insertion vecteur

la digestion de restriction. Tu choisis un site unique du vecteur qu'on retrouve aussi dans l'insert, tu digères et en fonction du nombre et de la taille des fragments tu peux dire s'il y a insertion et même si elle est bien orientée.  [...] Ok.merci on a choisi la PCR avec des amorces car la digestion de restriction je ne l'ai pas vu en cour. Par contre l'autre soucis c'est de savoir ensuite si je choisi une PCR/RFLP ou PCR/RAPD car meme avec les avantages et inconvénients des 2 je n'arrive pas à choisir.  [...]

[Génétique] taille moyenne fragments de restriction

Je bloque sur une question où l'on me demande de calculer la taille moyenne des fragments de restriction après digestion par ecoR1 (site reconnaissance. GAATTC) de l'adn humain.  [...] Après ça il ne te reste plus qu'a multiplier la fréquence d'apparition de GAATTC par le nombre de paire de bases dans le génome humain pour avoir le nombre de sites théoriques EcoRI dans notre génome. Et vu que tu désires avoir la taille moyenne des fragments, tu n'as plus qu'a diviser la taille du génome par le nombre de séquences EcoRI.  [...]