• Santé - Site, Digestion, Plasmide

[Biologie Moléculaire] plasmide recombinant et ADN ligase

- ta première digestion permet de linéariser ton plasmide au niveau d'un site AgeI.  [...] comment recirculariser ton gros fragment pour former un nouveau plasmide. D'un côté tu as une partie du site de restriction AgeI, et de l'autre tu as une partie du site de restriction de EcoRV. Tes bouts sont entiers... (tu n'as pas de sticky ends ) Alors, quelle enzyme catalyse la ligation de deux fragments d'ADN.  [...]

[Biochimie] Restriction bizarre

Combiend e site de coupe a le plasmide pour chaque enzime je pense a 2 pour BGIII au vu des résultas dans les pistes 2 et auncun pour PVUII (vu que le plasmide migre a la meme hauteur que le plasmide mon pote sans digestion) Cela voudrtait dire que les bandes dans les pistes 2 et 3 correspondent au plasmide linéarisé mais pourquoi n'ont -ils pas migré à la meme hauteur.  [...] ou bien vu que l'echantillon 4 ne semble exister qu'en forme linéaire, il est possible qu'avec PvuII, il n'y ai pas de coupure (si la coupure pour donner la forme linéaire a été faite au niveau du site de restriction que reconnait PvuII), ou alors 2 fragments et donc 2 bandes qui migrent plus loin que la simple forme linéaire du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Meilleure résolution pour gel d'agarose

J'ai commandé un gène dans un plasmide avec les site de restriction qui vont bien de chaque côté et comme j'ai beaucoup de chance, il se trouve que le vecteur qu'il m'ont envoyé contient également ce fameux site de restriction. Je me retrouve du coup avec 3 bandes au lieu de 2 sur mon gel après digestion.  [...] On arrive enfin à ma question. comment je pourrai faire pour améliorer la discrimination de mes bandes sur mon gel J'ai testé de passer de 1% d'agarose à 0.8%, c'est un peu mieux mais pas mirobolant. Des idées Sachant que je fait migrer 5min à 70V puis 25/30min à 150V. Si je diminue le voltage, ça sera mieux.   [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

Par exemple, pour un plasmide ayant 3 sites de coupures, le nombre de fragments attendu (théorique) est de 6 si l'on considère tout les fragments possible et imaginable. Mais dans le cas d'une digestion incomplète, comment savoir s'il y aura 1 seul site ou 2 site qui seront impliqué dans la digestion du plasmide.  [...] dites moi svp comment peut on trouver le nombre de fragments d'ADN produits lors d'une double digestion du plasmide pCR-gai par les enzymes de restriction HindIII et EcoRI et leurs tailles respectives.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

on a digéré un plasmide pBR322 par différentes enzymes et chacune de ces digestions a été soumise à une electrophorèse en gel d'agarose pendant 45 min.  [...] mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.  [...] Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

En fait, j'ai fait un clonage. j'ai essayé d'inserer un gène (2,5kb) dans un plasmide (10kb, pCambia 1300), en aval d'un promoteur (qui lui est déjà préalablement inséré dans le même plamide). Mais comme je travail sur un même site (SacI), j'ai réussi (après beaucoup de galère) à avoir une clone positive mais avec mon insert inversé (criblé par pcr et vérifié par digestion).  [...] - plasmide sensé avoir inseré mon fragment dans le bon sens (ce qui est en réalité après vérification par pcr et par digestion ne contenant pas du tout mon insert) = entre 10 et 20kb.  [...]

PCR, template et riz anti-alzheimer

Enfin, dernière petite question, les auteurs ne parlent absolument pas de la manière dont ils activent le gène une fois inséré. Vous avez une idée.   [...] 4) Je n'ai pas le temps de lire le papier, mais en général le plasmide contient un promoteur qui permet une expression plus ou moins forte de ce qui se trouve derrière. Ca dépend du tissu cible, de si on veut une expression constitutive ou inductible, etc.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...] C'est vrai que sur gel apres digestion les inserts sont assez faible par rapport au reste de plasmide, est ce que le fait d'augmenter le temps de digestion pourrai augmenter mon taux d'insert.  [...]

calcul dilution plasmide

et dans se protocole le volume final est de 50ul est ce que vous pouvez m aider pour savoir combien de ul de ce plasmide je dois utiliser.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]