• Santé - Sérum, Humain, Couple, Révélation

Western blot- serum humain

En effet j'ai un antigène de P. falciparum contenu sur une membrane de nitrocellulose, j'aimerai savoir si les anticorps contenus dans du plasma humain reconnaissent cet antigène. Pour cela je dispose de plasma humain, d'anticorps anti IgG humain couplé à de la Phosphatase Alcaline (PA) fait dans la souris.  [...] Ma stratégie est. d'incuber dans un premier temps la membrane avec le serum humain puis d'incuber avec les IgG couplé à la PA qui me servira à la révélation. Seulement je ne sais pas comment préparer et à quelle concentration utiliser les plasma humain. Quelqu'un pourrait t-il m'aider pour la préparation des plasmas.  [...]

[Immunologie] Elisa: Help pour blocage du non spé dosage d'anticorps

Ensuite on fait 3 lavages, puis on incube le sérum de patient dilué au 1/100 en PBS/BSA 0.05%/tween 0.05% 1h à 37°C, suivi de 3 lavages. La dernière étape est l'incubation avec un anti-human IgG-PAL, puis révélation au pNPP.  [...] Le problème rencontré est un bruit de fond encore trop élevé lorsque le sérum est incubé dans les puits revêtus de streptavidine mais non coatés avec le peptide (DO entre 0.35 et 0.45 selon les échnatillons). Pourtant ces puits sont prébloqués au superblock par Pierce lors de la fabrication des plaques.  [...]

[Immunologie] protocole immuno-histo-chimique

c'est la révélation. ton anticorps secondaire est couplé a une peroxydase, qui transforme le DAB en un produit coloré, donc localisé la ou Ki67 se trouve (d'ou l'intéret d'inactiver les perox. qui trainent un peu partout).  [...] Pour les peroxydases endogènes, ce sont les peroxydases qui sont présentent dans ton tissu avant que tu n'ajoutes ton anticorps couplé à la peroxydase. Ces peroxydases endogènes utiliseraient la DAB exactement comme ton système de révelation et génereraient du bruit de fond.  [...]

[Biochimie] anti LC3 humain aucun marquage en Western blot

Bonjour, est ce que quelqu'un a une experience de western blot sur extrait de cellules humaines avec l'anticorps de lapin anti human MAP LC3 beta (H-50) sc-28266 de chez santa cruz biotech (marqueur d'autophagie). Je ne sors aucune bande specifique vers les 16-18kDa attendus avec des extraits de HeLa pretraitées ou non pour favoriser l'autophagie.  [...] J'ai essayé avec du cerveau de souris (censé etre un bon temoin positif). Toujours rien à la bonne taille. La technique de western n'est pas en cause car le marquage actine est impecable. Le LC3 est sensible à la degradation, donc les extraits sont realisés en presence d'inhibiteurs de proteases.   [...]

[Biologie Moléculaire] immunohistochimie sur rein de souris

Je dois faire une immunohistochimie sur des sections de rein de souris. J'utilise un protocole où je masque avec de l'eau oxygénée la péroxidase endogène puis je bout les sections dans du citrate de sodium pour réveler l'antigène. Je bloque avec de la BSA/PBS dans laquelle j'ai de la streptavidine puis le premier anticorps avec de la biotine dans la solution.   [...] Pour la révèlation j'utilise un second anticorps couplé à l'HRP puis la solution ABC (avidin-biotin complex) et enfin le DAB comme chromophore.  [...]

[Biologie Cellulaire] Anticorp anti-espece et Western Blot

L'anticorps secondaire (que tu as nommé AC2) est celui qui va te permettre de mettre en évidence la réaction AC1-protéine d'intérêt. cet anticorps (AC2) sera couplé à une molécule qui permettra la révélation (en général l'enzyme HRP, peroxydase de raifort).  [...] Cet anticorps sera lui dirigé contre l'anticorps primaire, c'est un Ac anti AC1. Par conséquent dans l'exemple, si tu as utilisé un anticorps de souris comme AC1, l'AC2 sera un anticrops anti anti-corps de souris, produit par exemple chez le lapin. le couple AC1-AC2 n'est pas produit dans la même espèce animale, puisque l'AC2 est censé reconnaire l'AC1 comme un antigène.  [...]

Ird800

Je suis en stage à l'INRA et je travail avec une amorce couplé à IRD800 je sais qu'elle émet à 800nm. Mais étant entièrement novice en optique, je me demande si aprés une PCR avec cette amorce je peux obtenir une révélation lors de la photo au UV.  [...] Tous mes témoins négatifs montrent une bande, et c'est pas bien.   [...]

[Immunologie] Analyse réponse humorale par ELISA

Pour la révélation, nous avons utilisé un anticorps secondaire couplé à la phophatase alcaline (AP) puis nous avons ajouté le substrat (PNPP) de cette enzyme. Jusque là tout va bien. Ce que je ne comprends pas, c'est pourquoi nous avons dilué le substrat dans du tampon diéthanolamine.  [...] je ne serais pas d'une grande aide mais le seul élément que je peux apporter à ta question c'est que le tampon diéthanolamine a remplacé le tampon glycine/NaOH car il s'est révélé plus efficace. En quoi Je ne sais pas.   [...]

[biologie moléculaire] opéron lactose

je demande essentielement lorsque par exemple je place une bactérie dont le genome n'est pas affécte par des mutations dans un milieu de culture qui ne contient pas des sources de nutrition (ne contient ni lactose ni la resultat de la catabolisme de ce dernier signifie du glucose et du galactose ),dans ce cas l'operateur est occupé par le represseure et par la suite pas de transcription,et d'aprés mes connaissance je sait que le gene lacA donne une protéine qui transforme des autres types des molécules en des analogues du lactose(par exemple le cholesterol)lors de l'epouisement de la cellule,mais comment se fait ce ci si l'operateure est bloqué par le represseure.   [...] transformation de bactéries lac- avec un plasmide codant pour le promoteur de l'operon lactose couplé au gène lacz ou CAT et vous regardez le niveau d'expression basal du gène par spéctrométrie après révélation de la présence de l'enzyme que vous aurez choisi (pour le lacz j'utilise le x-gal, pour CAT j'utilise plutôt un test elisa).  [...]

Problème de WB, HRP sensible à la lumière ?

Je n'ai jamais entendu que l'AC secondaire couplé à la HRP était sensible à la lumière, et quand je faisais des western blot je ne réalisais que l'étape de révélation à l'obscurité.  [...] Merci pour vos réponses. C'est bien ce que je pensais, c'est seulement les solutions de révélation qui doivent être protégée de la lumière.  [...]