• Santé - Séquence, Vecteur, Expression

[Biologie Cellulaire] Vecteur d'expression transitoire

Oui il y a expression de ton plasmide sans séquence Ori car cette séquence est nécessaire pour la réplication du plasmide et c'est une origine de réplication procaryote lorsqu'on fait des expressions transitoires car on produit les plasmides chez E. coli. Pour initier la transcription on utilise la plupart du temps le promoteur fort du cytomégalovirus (CMV) que l'on place en amont de la séquence codante.  [...] Tout à fait, c'est ce qu'il faut mettre dans ton vecteur d'expression, et tu peux rajouter aussi entre la séquence codante et le signal de polyadénylation une séquence intronique. Habituellement on utilise celle du virus SV40. L'épissage du pré-ARNm favorise l'export de l'ARNm qui fait partie des régulations de l'expression génique eucaryote, et donc là tu favorise encore une production massive de ta protéine.  [...]

[Biotechnologie] vecteur de clonage et vecteur d'expression

CA peut être plus ou moins similaire, a part que le vecteur de clonage est fait pour être réplicable en bactéries (comme une sorte de vecteur navette ou on insère ce que l'on veut pour l'amplifier, c'est a dire qu'il contient des origines de réplication, des sites de clonages, etc), tandis que le vecteur d'expression est lui équipé des éléments nécessaires a l'expression de ta séquence, que ce soit expression procaryote ou eucaryote.  [...] donc si j'ai bien compris, le vecteur de clonage s'utilise in vitro alors que le vecteur d'expression est inséré dans une bactérie pour exprimer le gène d'intérêt.  [...]

[Biologie Cellulaire] Séquence nucléotidique des protéines.

On raboute suggère plutôt que l'on est en train de parler de clonage. Il s'agirait donc de l'ADNc que l'on insert dans un vecteur (vecteur d'expression) en phase avec la séquence codante pour une enzyme (betagalactosidase, lucide case, chloramphénicol acétyle transférase, etc).  [...] L'idée peut être ici de suivre l'expression protéique de la protéine d'intérêt en suivant l'activité de l'enzyme rapportrice.  [...]

[Biologie Moléculaire] shRNA

Peux-tu nous donner un peu plus d'indications de ce que tu veux faire et sur quel point tu as besoin d'aide pour ton design Tu veux cloner ta séquence shRNA dans un vecteur d'expression.  [...] Sinon je sais qu'il existe des programmes en ligne qui te proposent en fonction de la séquence de ton ARNm des séquences siRNA en tenant compte de tout un nombre de critères mais malheureusement je n'ai pas en mémoire lesquels... Dans ce cas il faut que tu testes 3 séquences différentes contre ta cible pour t'assurer que l'une au moins va fonctionner.  [...]

séquence kozak

je souhaite faire une transgénèse chez la drosophile, je dispose d'un vecteur possédant le promoteur qui m'intéresse. De plus, j'ai également l'ADNc d'interet avec les séquence 5' et 3' UTR mais je clone directement à l'ATG. Je vais créer un site de restriction avant cet ATG afin de pouvoir le cloner faut il aussi que j'ajoute une séquence Kozak pour avoir une bonne expression de ma prot ou n'est ce pas nécessaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

j'ai ensuite séquencé mes produits d'amplification (amorces dessinées spécifiquement en 5' et 3' de mon insert) pour vérifier que mon insert était correct et surtout entier. Et là, problème ma protéine est tronquée de 4nulcéotides... (sans doute dû à une mauvaise hybridation de mon amorces et donc mauvaise amplification.  [...] Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

3-si par exemple on coupe un plasmide par Bamh1 et on insere une sequence d'adn. Comment peut on verifier la presence de ce fragment ajoute dans le plasmide.  [...] Le vecteur d'expression contient en plus de la séquence de résistance et du site de multi-clonage et du site d'origine, il contient en plus un promoteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

On met ensuite une ligase qui va joindre les différents fragments entre eux. on a alors une séquence double brin d'ADN qui contient l'information génétique de la protéine voulue. Ensuite il faut insérer cette séquence dans un vecteur d'expression. Donc on aura pensé à ajouter des sites de restriction de part et d'autre du gène synthétique pour pouvoir l'insérer dans un vecteur.  [...] Et ils optimisent les codons pour l'expression dans l'hôte choisi, ils optimisent les séquences pour la stabilité des mRNA, et on peut leur imposer des sites de restrictions dans le gène (pratique pour faire des cassettes)... Si on leur donne le plasmide d'expression, ils font même le clonage (mais il y a un surcoût de quelques centaines d'euros).  [...]

[Biologie Moléculaire] Binding tests sur enzyme

Je sais qu'il est possible de faire un test d'activité (mesure de l'activité de l'enzyme en présence des molécules inhibitrices) mais j'ai l'impression que ce test est difficile à mettre en place et assez coûteux (pour tester des milliers de molécules). Je sais qu'il est cependant nécessaire pour définir certains paramètres (donc à utiliser sur les molécules qui ont passés les tests de binding).   [...] J'ai aussi pensé à utiliser les tests de binding classiques mais il faut que les protéines soient membranaires. J'ai donc cherché comment amener mon enzyme à la membrane (création d'une protéine chimère), mais je ne trouve rien. Il doit pourtant exister un vecteur avec une séquence signal et une suite d'acides aminés aliphatiques permettant l'expression membranaire de mon enzyme.  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]