• Santé - Séquence, Phase, Sites, Restrictions

[Biochimie] Gfp

Est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer comment on utilise la GFP pour marquer une proteine que l'on veut localiser Peut on marquer la proteine directement ou est on obligé de faire une fusion entre le cDNA et la GFP.   [...] Il existe plusieurs plasmides qui contiennent déjà la séquence codante pour la GFP en phase avec des sites de restrictions permettant de cloner le cDNA. En gros, ça ne change rien par rapport au clonage dans un vecteur d'expression basique en terme de manip'.  [...]

[Biologie Moléculaire] Site de restriction

Je vais cloner un gène dans un vecteur (pET21a et pGEX 4-T-2) et je vais ajouter des sites de restrictions dans mes primers avant de lancer la PCR. Quels procédures peut-on suivre pour faire introduire des sites de restrictions dans les séquences de nos oligonucléotides dans le but d'une expression dans Ecoli par exemple le sens de lecture du vecteur/lecture en phase, présence de ces enzymes dans polylinker, enzymes ne coupent notre gène.  [...] Ce n'est pas bien compliqué dans le principe, il s'agit simplement de designer, disons les 20 premières bases de votre séquence et de coller un site de restriction devant. Comme les enzymes de restrictions sont des endonucléases, il faudra aussi bien penser à mettre 6 bases en amont.  [...]

[Biochimie] Rechercher sites de restriction

Déjà connais-tu des programmes online permettant de trouver les sites des enzymes de restriction connues sur une séquence donnée Quelle peut être l'utilité du programme que tu décris, s'il existe (ce qui m'étonnerait beaucoup).  [...] J'ai trouvé le programme dans lequel j'entre une sequence et je choisis une enzyme puis je récupère ma sequence avec des espaces aux niveau des sites de restrictions correspondant a l'enzyme choisie.  [...]

Déchiffrage d'une carte de plasmide

Les 2 lignes au dessus du plasmide correspondent aux différents sites de restrictions (éventuellement pour cloner une séquence dans ces poly-linker).  [...] Juste avant les sites de restriction tu as bien sûr un promoteur pour initier la transcription de ta séquence (Pcmv). Les séquences Ori sont les origines de réplication du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Programme de clonage

Par exemple, tu veux faire un cloner une séquence que tu vas amplifier par PCR avec des sites de restrictions dans les primers pour l'insérer dans le vecteur cible.  [...] - Deuxièmement, lui demande de construire ton plasmide. Tu lui donnes ta PCR avec les deux sites de restriction, et de l'autre ton plasmide cible avec tes deux sites. Et tu récupère la séquence totale de ton nouveau plasmide. Je ne m'embette plus à faire ça sur papier et à vérifier 20 fois si j'ai fais une erreur de phase ou autre en tapant mes séquences vu que tout est déja sur le mac.  [...]

Température d'hybridation et PCR

pour obtenir une amplification il suffit que l'extrémité 3' de chaque amorce soit bien hybridée. c'est comme ça qu'on obtient des amplifications non spécifiques ou qu'on ajoute des sites de restrictions à une séquence d'ADN.  [...] En cas de compétition entre 2 sites d'accrochage d'une amorce, c'est le produit le plus court qui est plus facilement amplifié même si l'hybridation de l'amorce sur la séquence est imparfaite.  [...]

[Biologie Moléculaire] logiciel clonage

connaissez-vous un logiciel permettant d'ajouter des sites de restrictions sur une séquence un logiciel de préférences gratuit.  [...] En effet, certains appellent cela le clamp et il permet d' internaliser le site de restriction. En effet, les enzymes de restrictions sont des endonucléases si bien que leur site de coupure doit être à l'intérieur d'une séquence ADN, et non en bordure.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

L'objectif de ce clonage est de récupérer une partie d'un vecteur, pour se faire une amorce foward a été faite pour pouvoir intégrer un nouveau site de restriction, l'amorce reverse elle doit intégrer plusieurs sites, l'insert que l'on doit obtenir doit faire environ 1500-1600bp.  [...] Franchement si ça déconne arrêtez de perdre du temps et faites synthétiser la séquence. Pour 1500pb il y en a pour 500¬, c'est vraiment rien. Et en plus vous pourrez vous amuser à mettre sites de restrictions, mutations, etc, ou vous voulez et à votre convenance.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...] Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème. il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

Pour ta dernière question, il faut bien sur faire sauter le stop de la stathmine. Il y a plusieurs options. soit tu as un site de restriction bien placé, soit tu places la GFP après et tu modifie le codon stop en mutagénèse dirigée. Truc capital. les ADN codants pour ces deux protéines doivent être insérées dans le vecteur EN PHASE.  [...] Tout a fait, si tu as une carte de restriction tu peux couper a la base pres. Il faut juste avoir un site bien placé. Comme ça tu peux supprimer la fin de ton ADNc et le rabouter a ton autre gène, sous réserve de sites de restrictions bien placés sur l'un et l'autre des fragments et qui permettent un assemblage en phase.  [...]