• Santé - Sec, Appareil, Transfert

[Biochimie] Comment optimiser le transfert (en western blot) des protéines de haut poids moléculaire ?

Il n'y a pas de tampon de transfert étant donné que c'est un transfert à sec. Une fois que ton gel a migré, tu utilises un appareil spécial pour cela et en quelques minutes, c'est transféré. Ca revient un peu plus cher que la méthode classique (7 à 8 euros par transfert de mémoire) mais pour les grosses protéines ça marche largement mieux.  [...] Ces dernières semaines j'ai essayé plusieurs méthodes de transfert d'après les conseils du service technique de BioRad, mais sans succès. Ils sont prêts à nous prêter l'appareil de transfert à sec. Vu que ceci est mon dernier recours, je n'aimerais pas le rater.  [...]

[Biochimie] Extraction d'une protéine nucléaire pour WB

un conseil pour les grosses protéines comme la tienne, il est recommandé de faire un transfert sur la nuit (ca transfert tres mal).  [...] merci du conseil. J'ai déjà essayé de mettre au point le temps de transfert. En semi sec et avec l'appareil de transfert qu'on a (appareil bio-rad, petit gel, epaisseur du gel 1mm max) 1h de transfert fait passer les prot sur le papier wattmann. Mais peut être qu'a l'époque j'avais pas regardé si haut donc cela coute rien de remettre cela au clair.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot: Transfert incomplet

Jusque là tout va bien mais malgré un bon nombre d'essai je n'arrive pas à avoir un transfert complet de mes extraits protéiques sur ma membrane. Ma protéine fait 80 kDa et j'utilise un appareil de transfert liquide (Bio-Rad) avec des membranes de nitrocellulose.  [...] L'ethanol a le même effet que le méthanol Sinon je fait des gels a 10% et pour le transfert semi-sec, le probleme est que je n'ai pas d'appareil pour dans mon labo et si je me souviens bien c'est surtout conseillé pour les protéines de moins de 60 kDa non.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot brûlé

J'expose mon problème.. Dans le cadre d'un TP j'ai dû effectuer un Western Blot. Au moment où j'ai voulu récupérer ma membrane de nitrocellulose après transfert, il s'est avéré que tout à cramer./ La seule erreur de faite est que j'ai inversé l'anode et la cathode au niveau du générateur.  [...] tu es sur de ne pas t'etre trompé de voltage/ampérage C'etait un transfert en semi-sec j'imagine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Si ton marqueur est transféré, c'est que le transfert fonctionne. Quelle quantité de B-actine déposes tu à migrer Parce que le rouge ponceau a une limite de détection de 250ng et il ne fonctionne pas terrible avec les membranes en PVDF.  [...] Bonjour, c'est encore moi, et j'ai toujours pas réussi à optimiser mon western blot, j'ai tout tenté, même de changer d'appareil pour le transfert sur membrane.  [...]

[Biochimie] Western blot

Selon si le transfert et semi sec ou non pourquoi il y a t'il des variations dans la composition de tampon des grosses variations parfois même il mettent un peu de SDS pour essayer d'augmenter le transfert mais bon.  [...] Evidemment, la membrane ne se mouille pas aussi vite qu'avec du methanol, mais generalement je l'equilibre 5 min avant le transfert et mes blots sont nickel.  [...]

[Biochimie] Questions Coomassie et Western Blot

Même question pour le tampon de transfert pour les WB semi-sec.  [...] Le méthanol et l'éthanol rendent le gel plus poreux, ce qui permet de faciliter les échanges avec le tampon (que ce soit de transfert ou de staining en coomassie). Cela permet une meilleure pénétration du coomassie dans le gel pour colorer les protéines, et cela facilite la sortie des protéines du gel pour le transfert.  [...]

[Biochimie] Transfert western blot raté

Bref, j'ai fait un transfert il y a 2 semaines avec un protéine purifiée...c'était magique. transfert impeccable, rouge ponceau OK et tout le reste aussi. Mais là je donne ma langue au chat, mon premier transfert était complètement de coté avec des bandes en zig-zag, on m'a dit qu'il devait y avoir une bulle qui a géné le transfert.  [...] Sinon, la conductivité électrique methanol est meilleure que celle de l'ethanol. En général on préfère remplacer le methanol par de l'ethanol, mais pour les transferts, c'est pas forcément la meilleure idée. Ceci dit je ne pense pas que cela joue à ce point, et puisque vous avez déjà eu de bons résultats.  [...]

[Biochimie] Western blot en pointillés

Avant je faisais un transfert identique à toi au niveau chimique (PVDF, méthanol sans SDS), 1 heure 30 à 400mA constant. J'avais les protéines de haut poids moléculaire qui se transférait mal vu avec les marqueurs de taille + PARP non clivé (110 kDa). Du coup je suis passé au même transfert mais d'une durée de 2h15-2h30.  [...] De plus, nous réalisons toujours le transfert semi-sec à température ambiante pendant 2h et ça marche bien pour tous nos anticorps.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

J'ai déjà testé de nombreux protocoles sans succès (méthodes d'extraction différentes, migration sur petit/grand gel, transfert liquide/semi-sec..), donc j'aimerais savoir si quelqu'un possède un protocole précis ou des indications.  [...] Et au niveau blot, j'ai déjà essayé pas mal de paramètres. petit/grand gel, faible pourcentage d'acrylamide (6-7%), transfert liquide éthanol/méthanol avec différents temps et voltage.  [...]