• Santé - Restriction, Séquence, Protéine

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Pour réaliser une protéine de fusion, la plupart du temps on ligue une séquence de restriction en 3' de l'ADNc codant la protéine N-terminal et la même séquence de restriction en 5' de l'ADNc codant la protéine C-terminale. On choisi une séquence qui une fois clivée génère des bouts collants.  [...] Et le positionnement de ces séquences se fait en accord avec le futur cadre de lecture de chacun des ADNc. Après ligation, on clive avec l'enzyme de restriction et on met les ADNc ensemble et en présence de DNA ligase (la IV je crois..) et avec de l'ATP. C'est un grand raccourci que j'ai pris là, juste pour se faire une idée.  [...]

Déchiffrage d'une carte de plasmide

La séquence de polyadénylation BGH est située juste derrière les sites de restriction ce qui permettra à ta séquence insérée de recevoir une queue polyA et tu obtiendra un ARNm fonctionnel (=traductible en protéine).  [...] Juste avant les sites de restriction tu as bien sûr un promoteur pour initier la transcription de ta séquence (Pcmv). Les séquences Ori sont les origines de réplication du plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

Dans le cadre de mon travail de thèse j'étudie l'expression d'une protéine. Pour commencer j'ai donc cloner le cDNA dans un vecteur d'expression pCDNA3 afin de le transfecter dans des HEK. Malheureusement il n'existe qu'un seul type d'anticorps contre cette protéine et le seul qui existe ne fonctionne absolument pas.  [...] Mon idée serait donc de créer des amorces PCR contenant en 5' un site de restriction commun à la séquence de ma protéine et se trouvant le plus proche possible de mon codon stop, et en 3' une partie de la séquence de la GFP afin de pouvoir amplifier la GFP.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique GST-Pull Down

c'est ça. Le truc c'est qu'il n'existe pas toujours d'anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt ou d'anticorps bien spécifiques alors que ceux qui reconnaissent la GST le sont. Il existe aussi des techniques pour récupérer la protéine sans le tag à la fin, par exemple en clonant un site de restriction SapI entre le cDNA de la prot et celui de la GST.  [...] L'enzyme de restriction SapI coupe la séquence d'ADN SapI et une protéase (dont j'ai oublié le nom) coupe cette même séquence une fois traduite.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage par PCR taille des amorces

Je me demandais donc la taille que devait faire mes amorces de PCR, et si je dois prévoir quelques bases entre le début (et la fin) de ma séquence codante et mon site de restriction. Car je me demandais si en juxtaposant les 2 sans rien ajouter entre, est ce que la coupure/ligation ne va pas endommager ma séquence codante.  [...] En général les oligos font 20-30pb et on essaye d'avoir un ratio équilibré entre les G+C et les A+T (dans ces conditions, une PCR aux température d'hybdridation classiques 51-58°C doit fonctionner). La restriction coupe ton ADN proprement, pas besoin d'ajouter des bases pour protéger ta séquence codante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problèmes: Recombinaison d'un plasmide

Si il n'y a pas de site de restriction utilisable encadrant ton gène, il va falloir en ajouter. On va donc ajouter 2 sites de restrictions différents de chaque côté de ton gène. Note que pour l'énoncé 1 tu peux utiliser 2 fois la même séquence de restriction car comme tu as déjà ton promoteur le sens d'insertion du gène n'a pas d'importance.  [...] fin de ta sequence-HindIII-NNNN), ceux ci désignent des bases qui peuvent éventuellement séparés les 2 sites de restriction sur ton plasmide qui ne sont pas forcément côte à côte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sequence a ajouter avant un site de restriction

[Biologie Moléculaire] Sequence a ajouter avant un site de restriction.  [...] Je ne pense pas qu'il y ait une séquence type, veillez juste à conserver un %GC correct et a ne pas créer de site de restriction qui serait ennuyeux par la suite.  [...]

Bioinformatique - Etudes d'une sequence d'ADN

Et je cherche tous ce qui pourrait me permettre de caracteriser cette sequence pour pouvoir la comparer ensuite que ce soit des criteres connus et evidents tels que la presence de site de restriction ou les pourcentage de nucleotides ou meme n'importe quelles idees.  [...] Tu peu xtoujours t'amuser a rechercher le site de restriction EcoRI, mais c'ets vraiment du temps perdu...Tu peux t'amuser a recherche la probablite de codage d'une sequence, mais ca ne te renseignera pas sur une quelqueconque similitude avec un autre virus.  [...]

[Biologie Moléculaire] shRNA

Sinon je sais qu'il existe des programmes en ligne qui te proposent en fonction de la séquence de ton ARNm des séquences siRNA en tenant compte de tout un nombre de critères mais malheureusement je n'ai pas en mémoire lesquels... Dans ce cas il faut que tu testes 3 séquences différentes contre ta cible pour t'assurer que l'une au moins va fonctionner.  [...] Pour faire un shRNA tu construis ton oligoN°1 en mettant. site restriction-séquence siRNA-TTCAAGAGA(boucle)-séquence siRNA à l'envers -site restriction (je te renvoie à l'article suivant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Faire du pGEMT soi-meme

Je crois que l'idée pour créer les T sortants est d'utiliser une enzyme de restriction type XcmI en adaptant la séquence de restriction.  [...] Maintenant, pour les produire, je pense que la méthode est celle que je décris, à savoir utiliser une enzyme de restriction qui génère un T sortant. Je ne vois pas vraiment de méthode biochimique intéressante qui permette un bon rendement de production de vecteurs.  [...]