• Santé - Restriction, Plasmide, Enzymes

[Biotechnologie] Construction plasmidique

Tu récupère ton gène à intégrer dans ton plasmide en l'amplifiant par PCR, c'est ensuite que tu digére t'es amplifiants en utilisant les mêmes enzymes de restriction que tu utilise pour digérer ton plasmide.  [...] Ensuite digestion des amplifiats obtenues par des enzymes encadrant le gène, et correspondant à là où tu veux le mettre dans ton nouveau plasmide, afin de le récupérer. Par contre si par construction plasmidique tu entend, logiquement, construire un plasmide entier, alors là lors de l'amplification des parties géniques sur des plasmides de stockage, les primers que tu utilise doivent posséder une partie liant le template et une partie non liant appelée overlap, d'au moins 40bp.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteurs, gènes et plasmides

J' integre dans les bact mon plasmide dans lequel j'aurais au prealable insere mon gene X (grace aux enzymes de restriction).  [...] Par pression de selection AB sur les bacteries, je vais pouvoir selectionner uniquement les colonies bact qui ont integrer mon plasmide (qui a un gene re resistance a la selection).  [...]

Clonage orienté

Après PCR, il faut digérer l'insert d'une part, et le plasmide d'autre part. Ces digestions vont permettent de générer des bouts cohésifs entre l'insert et le plasmide. Il suffit alors de choisir deux enzymes de restriction (peu importe lesquelles a priori).  [...] Il faut donc que je choisisse des enzymes présentes à la fois au niveau de la séquence T7 et SP6.  [...]

[Microbiologie] Analyse plasmidique

Je ne comprends pas comment conclure, lorsqu'on obtient plusieurs fragments de taille différentes à l'électrophorèse, qu'il s'agit bien de fragments différents et non du même fragment dans une configuration différente (forme linéaire, surenroulée..).   [...] Lorsqu'on observe des fragments de plasmide sur gel, cela veut dire la plupart du temps qu'on l'a clivé avec des enzymes de restriction. Il n'y a que la forme circulaire du plasmide qui peut être sous forme surenroulée, mais les formes linéaires le restent.  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Effectivement, le nombre de N équivaut à ce qu'il y a de part et d'autres des sites de restriction. Tu peux donc déterminer le nombre si tu connais la taille du plasmide. Mais possèdes-tu ces informations.  [...] Effectivement, (bon même si c'est à l'envers, tu peux déterminer la taille de ton plasmide (environ 300pb). Donc tu dois pouvoir calculer le nombre de nucléotides de chaque coté après coupure.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage dans plasmide

On me dit qu'un chercheur a isolé une petite quantité d'une certaine enzyme. Il a ensuite obtenu un clone génomique complet du géne codant l'enzyme, puis il le lia à un promoteur bactérien fort sur un plasmide. Une fois le plasmide introduit dans E.coli, il constata qu'aucune enzyme n'était produite.  [...] Il se peut en effet que ton gène soit mal inséré dans le plasmide ou pas du tout. De même si le plasmide qui est dans la bactérie n'est pas sous forme circulaire mais linéaire (à cause par exemple d'un mauvais choix d'enzymes de restriction lors de l'insertion du gène) il ne sera pas transcrit par la bactérie.  [...]

clonages

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques.  [...] Pour la deuxieme, bien sur, il faut debarasser l'insert et le plasmide de l'enzyme de restriction avant la ligation. et une purification me semble plus sure q'une inactivation par la temperature.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

je crois que je confonds les sites de restriction présent sur le plasmide et les enzymes de restriction que l'on ajoute aux amorces pour faire la PCR.  [...] [Pour une PCR, on ajouter parfois des enzymes de restriction pour cliver l'adn, selon exactement le même principe décrit ci-dessus, il n'y a simplement pas d'insert de gène, donc pas de source de confusion any more normalement^^].  [...]

[Biologie Cellulaire] Clone du gène CRO d'un bacteriophage

En fait, on souhaite cloner le gène CRO du'un bacteriophage lambda dans un plasmide pLV236 et on me donne comme carte de restriction.  [...] Je ne vois pas quelle(s) enzymes(s) de restriction je dois utiliser pour le clonage de CRO, sachant que dans mon plasmide est deja present un P/O lac, une origine de replication, LacI et AmpR.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

Merci pour votre réponse. (je connais mon cours et ca fait longtemps que je cherchais la réponse à ma question). ce que je ne comprenais pas c'est que dans mon énoncé on me parle d'un plasmide et non d'une cellule. on a digéré le plasmide pBR322 par différentes enzymes de restriction.  [...] Pourquoi parle-t-on de volume Si je coupe en un site de restriction unique, j'aurai une molécule linéaire, càd que mon plasmide circulaire du départ sera devenu linéaire. Là, il n'y a plus de considérations de topologie.  [...]