• Santé - Restriction, Amorces, Plasmide

digestion PCR

Bonjour tout le monde, j'ai besoin de votre aide. J'ai un problème avec mon gel.   [...] Après avoir digéré mon insert (un produit PCR avec 2 amorces) et mon vecteur (un plasmide extrait par miniprep) avec 2 enzymes de restriction, je voit sur gel 3 bandes au même niveau. J'ai utilisé un plasmide (extrait de la miniprep) non digéré comme contrôle qui était à un niveau un peu plus bas des autres. Est-ce que c'est normal.  [...]

[Biologie Moléculaire] blunt-end ligation

Je dois réaliser un clonage assez classique. J'ai mon insert amplifié via la Phusion (et les amorces ne comportent pas d'ajouts d'enz de restriction en 5', c'est juste pile le gène d'intéret qui était dans un autre plasmide). J'ai mon vecteur de destination.  [...] Est-ce que je dois déphosphoriler mon plasmide Un traitement spéciale pour mon insert (a priori avec la Phusion, vu que c'est une proofreading, rien à faire de plus non).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation

Ca fait deux semaines que je tente de faire une ligation entre pCLNCX et mon insert. J'ai coupé mon plasmide par HindIII et amplifié mon insert avec des amorces contenant le même site de restriction HindIII, la taille de mon insert est bonne. celle de mon plasmide aussi, il a bien été digéré car j'ai comparé le plasmide digéré ou non.  [...] est- ce - que tu as procédé à une déphosphorylation de l'extrémité 5' de ton plasmide digérée l'utilisation d'une phosphatase alcaline est necéssaire dans l'étape qui précède la ligation puisque tu utilises un seul enzyme de restriction... car au moment de ligation il va être plus facile à un plasmide de se recirculariser plutôt qu'intégrer une autre séquence.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR?

Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction. alors la c'est definitif je suis dans le champs, je vais attendre que l'image soit validee pour voir si ca m'eclaire.  [...] ok, alros pour mes amorces 3 et 4 il faut que je fasse attention a chevaucher un site de restriction de preference a bouts francs pour une fois mon doublet final obtenu pouvoir le remettre dans mon plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

J'ai une question en ce qui concerne le clonage avec un plasmide, j'ai cru comprendre quelques trucs mais j'ai peur de m'embrouiller avec la PCR en ce qui concerne les enzymes de restriction.  [...] je crois que je confonds les sites de restriction présent sur le plasmide et les enzymes de restriction que l'on ajoute aux amorces pour faire la PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment design des amorces PCR..

Bah oui justement le site de restriction je dois le mettre au début de mes amorces pour pouvoir l'insérer ensuite dans le plasmide de la bactérie digérée par BamH1 et Sma1. Mais je sais pas s'il faut compter les nucléotides (qui font donc partie de l'amorce.  [...] Et en fait ouais je m'étais emmêlé les pinceaux avec les sites de restriction, sur ma fiche ils étaient ecrits à l'envers, donc j'ai fait n'importe quoi en faisant les premières amorces.  [...]

Carte de restriction

Qu'est-ce qu'une carte de restriction Reportez les résultats sous forme linéaire en indiquant les sites de restriction pour le plasmide A et B.  [...] Le même exercice donnera 4 cartes avec le plasmide B. Le positionnement adéquat des 3 sites de restriction dans le plasmide B génère 4 cartes de restriction possibles dont les 3 fragments de 500, 1000 et 2000 pb permet déjà d'exclure la proposition de Naomie avec son agencement initial en 5'-2000/500/1000-3' (3 sites de restriction aux positions 1, 2000 et 2500 (ou bien aux positions 278, 2278 et 2778, comme vous voulez...)).  [...]

carte de plasmide

connaitriez vous des sites qui permettent d'avoir les cartes de plasmide, afin de connaitre les enzymes de restriction ainsi que la taille des plasmides...pour ceux qui n'ont pas DNA strider.  [...] Je l'utilise depuis plusieurs années, et il est vraiment facile de prise en main (comme d'autres choses). Bref, on peut designer des plasmides, faire des cartes de restriction avec une enzyme ou un lot d'enzymes, définition d'amorces PCR, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

Voilà, je n'ai pas compris la correction d'un TD à propos de la PCR. Par le fait que l'on utilise des amorces oligonucléotidiques de synthèse, il est possible d'ajouter des séquences dans la région 5' de chaque amorce. Par exemple, un site de restriction aux 2 extrémités du fragment d'ADN synthétisé permettrons ultérieurement d'assembler le produit PCR dans un plasmide.  [...] C'est simple. l'amorce s'hybride partiellement, la partie qui contient le site de restriction et qui est donc indépendant de la région à amplifier dépasse.  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi.  [...] Effectivement, le nombre de N équivaut à ce qu'il y a de part et d'autres des sites de restriction. Tu peux donc déterminer le nombre si tu connais la taille du plasmide. Mais possèdes-tu ces informations.  [...]