• Santé - Réplication, Plasmide, Cellules

[Biologie Moléculaire] Plasmide

la transfection de cellules eucaryotes est possible. Par lipofection, éléctro, microbalistique etc...Par contre contrairement au bactérie va se poser le problème de réplication. Car le plasmide n'est pas au réplicome dans les cellules eucaryotes supérieur.  [...] Cet antigène permet au plasmide d'être répliqué par la cellule, et donc d'être conservé pendant une période plus longue. Sauf exception, la présence de cet antigène est absolument nécessaire dans les cellules de mammifères pour qu'il y ait réplication d'un plasmide.  [...]

Carte plasmide pcDNA 3.1

Je sais que les ori servent à initier la réplication, mais je croyais qu'un plasmide se répliquait d'un seul coup et toujours à partir du même endroit, donc pourquoi il y a 3 ori différentes (SV40ori, pUCori, f1ori) Et SV40pA qu'est ce que c'est.  [...] La cassette de sélection néo peut etre utilisée pour sélectionner des cellules eucaryotes, du coup pour que le messager fonctionne il faut qu'il soit polyadenylé (d'ou le sv40pA).  [...]

[Biologie Moléculaire] Question purification QIAprep

Si tu ajoutes du Cm ici c'est pour augmenter le nombre de copie du plasmide. J'imagine que tu dois l'ajouter quand tes cellules sont a DO 0.6-1.0 En fait le Cm va inhiber la traduction, du coup les cellules vont arreter de pousser, mais la replication de l'ADN va continuer.  [...] En fait le Cm va inhiber la traduction, du coup les cellules vont arreter de pousser, mais la replication de l'ADN va continuer. Ta DO va donc etre stable, mais la quantite d'ADN et donc de plasmide va augmenter. Du coup tu vas recuperer plus de plasmide tout en utilisant un kit pour une miniprep.  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

Ensuite, tu l'insert dans un plasmide, possédant une origine de réplication E.Coli, avec un gène de sélection (ex.. Résistance à lampiciline).  [...] il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...]

[Biologie Moléculaire] conversion d'un plasmide

En fait la question est surtout sur la distance entre l'ori et le marqueur car dans tous les plasmides que j'ai, et que j'ai vu, il y a toujours une distance entre les différents éléments du plasmide. Or ici je veux essayer de garder le plus possible la séquence d'origine.  [...] tu peux songer a foutre une origine de réplication virale type SV40 par contre je sais ce que ca donne en système de production.  [...]

proteine ou cellule stable ???

i) transfecter avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt, puis effectuer sa manip sur les cellules (dans ce cas, toutes les cellules n'exprimeront pas la protéine, et celles qui le font, élimineront en quelques génération le plasmide).  [...] ii) transfecter stablement avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt et un gène de résistance, on ajoute un agent de sélection, donc seuls les cellules qui possèdent le plasmide survivent, et au final, il y aurait intégration du plasmide dans le génome.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Dans ta population de cellules après transfo seulement une partie a pris le plasmide. Si tu n'as pas de marqueur sur ce plasmide pour le sélectionner tu ne sauras pas si ta transfo a marché mal/bien/très bien et donc l'efficacité de ta transfo.  [...] J'utilise des HEK-293 et mes conditions de transformations pour cette souche sont optimales (~ 90% de cellules transformées). J'ai déjà transformée cette lignée avec d'autres plasmides qui ont bien exprimés leur gène donc je doute que ça soit la transformation qui pose problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un plasmide à partir de cellules mammifères??

Pensez-vous qu'il soit possible d'isoler et purifier un plasmide (EBV = pas d'intégration et expression à long terme sous sélection) à partir de mes lignées cellulaires transfectées.  [...] Merci des conseils je ne sais pas si je vais le faire tout de suite mais si j'essaie je vous tiendrai au courant. En fait mon idée serait de faire une sorte de criblage car en gros je complémente un phénotype de blocage du cycle en transfèctant certains micro-ARNs et je me dis qu'en transfectant un pool de micro-ARNs (exprimés via ce plasmide) je pourrai récupérer les clones qui poussent et alors regarder quel(s) micro-ARN(s) a favorisé la prolif.  [...]

Plasmides

pourquoi l'insertion d'un plasmide réplicatif est létal ça ne dépend pas de son origine de réplication. Les plasmides de bactéries ont une ori 2µ non et ils se répliquent.  [...] En plus chez les bacteries il existe un systeme d'incompatibilite de plasmides, ce qui fait qu'il y a un controle strict du nombe de plasmide. En multipliant les origines de replications on s'affranchit de ce probleme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage dans plasmide

Si ce n'est pas le cas, est-ce que ceci est du au fait que certains génes ne sont actifs que si leurs sites de regulation sont occupés Si ces sites de regulation ne sont pas également intégrés dans le plasmide, le géne ne s'exprimera pas dans la cellule hôte.  [...] Sinon pourquoi un plasmide linéaire ne sera jamais transcrit par la cellule Est-ce que c'est lié à l'origine de replication du plasmide.  [...]