• Santé - Quantité, Protéine, Puits

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Pourriez m'expliquer comment on fait pour normaliser une quantité de protéines lorsqu'on réalise un western blot, je sais qu'il faut utiliser des protéines comme la béta tubuline mais techniquement on fait comment.  [...] Et bien tu utilises un anticorps dirigée contre ta protéine de normalisation comme l'actine, la tubuline, le GAPDH... pour révéler sur la même membrane où tu as révélé ta protéine d'interêt. Si tu as déposé la même quantité de protéine dans les puits, ta protéine contrôle va te permettre de le confirmer visuellement.  [...]

[Biochimie] Comment lire et interpréter un Immunoblot ?

L'actine est, bien entendu, une protéine ubiquitaire dont on estime que les différents traitements appliqués aux cellules ne vont pas modifier la concentration. Ainsi, on s'en sert pour certifier que l'on a bien déposer la même quantité globale de protéine dans les deux puits (contrôle et expérimental).  [...] Concernant la quantité de PCNA j'avoue que là aussi je ne sais pas. Nous savons juste par l'énoncé que c'est une protéine chez l'humain qui est ubiquitiné quand il y a un stress. Peut-être que ces cellules contiennent naturellement autant de PCNA...car je ne pense pas qu'ils en ait rajouté dans les cellules.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

Elle serait quantitative si vous déposiez une gamme de concentration de la protéine que vous souhaitez quantifier. En général ce que l'on fait c'est que l'on utilise une protéine standard (l'actine) et on dilue les échantillons pour avoir la même quantité dans tous les puits.  [...] On streap la membrane et on effectue un immunomarquage de la protéine d'intérêt. Vous ne savez pas combien vous avez de protéine dans l'absolu. Mais le rapport prot d'intérêt/actine dans chacune des puits vous permet de dire qu'il y en a plus là que là. C'est relative ou encore semi quantitatif.  [...]

Techniques utilisées en lab de biomol - Page 2

Sur un gel de polyacrylamide coloré au bleu de Coomassie, est-ce qu'on peut déduire d'une bande à x kDa. tiens, cette bande à x kDa est présente partout. ça tombe bien, ça veut dire que la protéine Y, qui a justement ce poids moléculaire, est présente dans toutes les conditions.  [...] En fait, j'ai jamais bien compris l'utilité de cette expérience (Coomassie). Quand il manque des bandes dans certains puits, c'est nickel. Mais souvent on n'est pas très sur qu'elles manquent vraiment... Ou alors on n'est pas sur d'avoir la même quantité de protéines dans tous les puits.  [...]

[Biologie Cellulaire] Extraction protéique pour western blot

Même si mon protocole est peut être trop long, il est néanmoins complet, et peut être fait en une 1/2 journée. Au moins, il pourra comprendre toutes les étapes, savoir ce qu'il y a dans le tampon, savoir combien il mets de protéines pour son gel... Bien sûr que c'est pas primordial pour juste vérifier si ta prot est bien là dans ton extrait, mais bon, j'imagine que si sa manip marche, il va devoir en faire d'autres, avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits.  [...] Je disais juste ça parce que je me doute que la première fois que tu as fais une extraction prot à partir d'une boite, si tu n'avais pas dosé, tu allais mettre au pif une quantité de protéines. Avec un risque de charger trop (ou pas assez) ton puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] les ARNs et extraction

Les échantillons sont déposés 2 fois mais à des quantité différente (les puits d'en haut contiennent moins de quantité d'ARN que les puits d'en bas). Je ne vois qu' un smear et dans tous les autres cas on ne distingue rien. Ceci est lié à une dégradation de l'ARN Peut-on dire qu'il y a contamination avec de l'ADN ou des protéines comment expliquer que dans un cas il y a un smear et que lorsque que l'on en dépose plus il n'y a rien merci de vos réponses.  [...] par contre l'histoire du smeaur est étonnante je ne dirais pas que l'ARN soit hors gel mais totalement dégradé (c'est vrai que c'est étonnant qu'il y ai un smear dans le haut du gel avec un quantité moindre). En fait pour moi ce qui est en rouge devrait être l'emplacemenent du 28 et 18S et en vert et bleu l'ARN dégradé das autres puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] technique PIFE + fluroscence

Voila je me demandais qu'elle était la différence entre la méthode PIFE (Protein Induced Fluorescence enhancement) et une expérience de fluorescence sur une plaque 96 puits. Le but étant d'observer l'interaction entre 1 ARN et une protéine. Ce que je sais c'est qu'avec la PIFE, plus le pic de fluorescence est élevé plus l'interaction est importante.  [...] Du coup la PIFE serait une méthode quantitative avec une bonne sensibilité et la technique de fluorescence sur plaque 96 puits serait donc moins sensible. Par contre avec cette technique (96 puits) on peut quand même quantifier la fluorescence pour en déterminer l'interaction d'une protéine vis à vis d'un ARN ou ça reste une méthode qualitative.  [...]

Ramener concentration d'un dosage cytokine à la quantité réel de cellules.

J'ai effectuer un dosage d'une cytokine sur différents puits traités avec différents produits et je me suis aperçu que en fonction des produits utilisés, ma quantité de cellules n'étaient pas la même.  [...] Je m'explique. j'ai ensemencé 4 puits à la même concentration en cellules et je traite mes puits avec différents produits et lorsque je compte la quantité de cellules dans les puits après 24h de traitement, il s'avère que pour un des puits la quantité est très faible comme si il n'y avait pas eu de prolifération cellulaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dosage protéine

Je travaille sur des BL21 GFP et j'extraie les protéines totales par une simple lyse des bactéries dans deux situations. non induites et induites à l'IPTG. Avant de faire migrer sur polyacrylamide, j'aimerais doser mes protéines pour déposer la même quantité dans tous les puits.  [...] J'ai un nanodrop, mais la mesure à 280nm est polluer par la présence d'ADN dans mon échantillon. Je pensais faire une coloration des prot avec le kit BCA mais la lecture se fait à 562nm, or la GFP emet à 504nm. Si elle est colorée ca change peut-être la donne mais je ne sait pas trop.   [...]

[Biochimie] SDS page

le tampon phosphate permet l'extraction des protéine totales d'une poudre vegetale, au moin tu sera sure de l'existance de votres protéines, en plus c'est un protocol trés simple.  [...] C'est pas tellement le volume qui compte mais la quantité de protéine. Je trouve aussi que c'est trop de protéine pour avoir une belle migration.  [...]