• Santé - Quantité, Plasmide, Promoteur, Expérience

[Biologie Moléculaire] Essais luciferase promoteur miRNA

La question que je me pose est la suivante. Etant donne que l'expression des miRNA est differente des mRNA (a priori plus faible), est ce qu'il ne serait pas judicieux d'augmenter la quantite de plasmide promoteur+luciferase dans mon experience (par rapport au protocol pour promoteur mRNA).  [...] Si quelqu'un a deja fait un essai luciferase sur des promoteurs miRNA, je suis interesse pour savoir la quantite de plasmide utilise (par rapport aux autres plasmide transfectes).  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression d'un gène d'enzyme !

un viel homme a isolé une petite quantité d'attractase,une enzyme produisant une phéromone humaine puissante,à partir d'echantillon de cheveux de célébrités hollywoodiennes.Pour produire de l'attractase à son usage personnel,il a obtenu un clone génomique complet du gène de l'attractase,l'a connecté à un promoteur bactérien puissant dans un plasmide d'expression et a introduit le plasmide dans des cellules d'E coli.  [...] il a été anéanti de découvrir qu'aucune attractase n'etait produite par les cellules.Quelle est 'explication de son echec.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage dans plasmide

Il n'est pas nécessaire d'introduire dans le plasmide les sites de régulations spécifiques au gêne, car le plasmide (sans le gêne d'intérêt)peut déjà contenir divers éléments dont un promoteur et parfois d'autres éléments régulateurs, cela dépend de l'utilité que tu en as.  [...] On me dit qu'un chercheur a isolé une petite quantité d'une certaine enzyme. Il a ensuite obtenu un clone génomique complet du géne codant l'enzyme, puis il le lia à un promoteur bactérien fort sur un plasmide. Une fois le plasmide introduit dans E.coli, il constata qu'aucune enzyme n'était produite.  [...]

[Biologie Moléculaire] Dominant négatif

En fait, tu transfectes tes cellules (qui expriment la protéine sauvage à leur surface) avec un plasmide codant pour cette même protéine mais qui est mutée (souvent il y a une délétion de la partie intracellulaire du récepteur ce qui empêche la transduction de se faire).  [...] L'aspect de dominance n'a rien à voir avec la surexpression qui est un aspect purement technique (tout dépend du type de plasmide et donc du type de promoteur). A ce compte là dès que l'on surexprime un mutant c'est un dominant négatif... Le terme négatif vient au contraire du fait que ce type de mutant induit un phénotype muté à l'état hétérozygote (donc avec une quantité égale de protéines mutées et non mutées).  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteurs, gènes et plasmides

Généralement dans les plasmides que tu utilises pour faire tes clonages le promoteur est de base sur ton plasmide,il est compris de série on peut dire. Il servira pour le gène que tu insères dans ton multi site de clonage.  [...] il faut surtout faire attention qu'il soit spécifique de là ou tu vas faire exprimé ton plasmide, car un promoteur bactérien est différents d'un promoteur eucaryote ou viral.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

Enfin a en croire la carte plasmidique, votre protéine serait sous le contrôle d'un promoteur tac je vous conseil cette littérature,. http.//www.sciencedirect.com/science...78111988904404 vous y trouverez des éléments de réponse.  [...] J'avais eu le même probléme l'année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére. Pour moi c'était. BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l'IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d'induire á une DO tardive de 1.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Tous les promoteurs eucaryotes ne sont pas identiques certains fonctionne chez d'autres espèces (en général ce sont des gènes issus d'organismes pathogènes) mais selon mon expérience la plupart du temps ça ne marche pas. C'est pourquoi on utilise des plasmide dit d'expression qui ont un promoteur et un terminateur plus ou moins fort en fonction de ce que tu veux faire voir même inductible, provenant en général de l'organisme hôte.  [...] Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.  [...]

[Biologie Moléculaire] organisation plasmide

En fait tout dépend de ce que tu cherches à faire et du type de plasmide utilisé. De ce que j'ai pu voir, la plupart du temps on utilise un plasmide contenant un promoteur d'intérêt et on place dans le MCS le gène d'intérêt.  [...] Non il ne faut pas aller chercher trop loin. Si c'est un plasmide RAPPORTEUR, on veut mesurer l'ACTIVITE d'un PROMOTEUR en mesurant indirectement l'expression d'un gène quantifiable comme ß-galactosidase. Dans ce cas la, on a besoin DU PROMOTEUR d'intérêt et c'est lui que l'on clone dans le MCS en AMONT du gène rapporteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Deux questions d'annales PCEM1

Pour la 61, je ne sais pas du tout faire, et pour la 62, j'hésite entre l'item a) et b), en gros, je ne comprends pas comment on peut affirmer que c'est le plasmide P1 qu'il faut utiliser.  [...] Il vous faut l'insérer en sens inverse par rapport au promoteur, il vous faut donc un plasmide. promoteur-BamH1-Pst1. C'est le plasmide P1.  [...]

[Biochimie] nucléase

Le moyen couramment utilisé en labo est de virer le groupement phosphate des extrémités 5' générées après coupure. Pourquoi ne voudrais-tu pas que ça se réassocie. exemple, tu veux exprimer une protéine dans une bactérie pour l'étudier. tu insères le gène codant pour ta protéine dans un plasmide d'expression bactérien qui contient donc une cassette de clonage.  [...] Admettons voilà ton plasmide ouvert par deux enzymes différentes, une bleue une violette. -PROMOTEUR- site Enzyme de restriction 1 (du vide) site Enzyme de restriction 2 - TERMINATEUR-et on rejoint le promoteur puisque le plasmide est circulaire.  [...]