• Santé - Quantité, Plasmide, Culture

[Génétique] Production d'interleukine 2

Puis tu fais une culture sur boite de petri avec une sélection par un antibiotique correspondant à ton plasmide. De la tu repiques une colonie et tu fait une culture liquide à partir de cette dernière. A cette étape il est important de valider ta construction par un séquençage et une PCR, après avoir extrait une petite quantité de ton plasmide (ex.5ml de culture extrait par mini prep).  [...] L'Il2 étant sécréter, cela va te simplifier la vie... Après ta sélection, tu peux prendre ton surnageant de culture, le concentré un peu (centricon) et réaliser une analyse par électrophorèse SDS PAGE ou encore mieux en western blot afin de valider que tes cellules produisent ta protéine.  [...]

Biologie moléculaire: quantité de plasmide

On nous demande de calculer a partir d'une culture, la quantité totale de plasmide.  [...] Ensuite, expérimentalement, on n'est pas capable d'extraire toute cette quantité car il y a des pertes dues à l'extraction elle-même. On te dit que le rendement de l'extraction est de 75%. Combien peux tu alors espérer en récupérer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quantité totale de plasmide

Dans un premier temps, vous devez réaliser l'extraction des plasmides à partir de culture de bactéries. Pour chaque culture (A ou Amut), vous disposez de 12 ml contenant 3 × 10 puissance neuf bactéries par ml.  [...] Chaque bactérie contient 50 copies d'ADN de plasmide d'une taille De 3500 paires de bases ( même taille pour A et Amut). Le rendement de l'extraction est de 75 %.  [...]

Precipitation adn plasmidique

Bonjour, après une extraction d'adn plasmidique avec un kit qiagen, je me retrouve avec de faibles concentrations de plasmide. Je souhaterais donc le concentrer un peu afin de pouvoir par la suite le sequencer.  [...] Autre solution tu rajoute a ta culture sur la nuit un peu de chloramphenicol pendant quelques heures. Ca bloque la multiplication des bacteries mais n'affecte pas pas la replication de l'ADN. donc tu augmente la quantité de plasmide dans tes bacteries.  [...]

Qu'est-ce qu'un OGM : organisme génétiquement modifié ? | Dossier

La première étape consiste à cloner le gène YFG dans un plasmide. Un plasmide est une petite molécule d' ADN circulaire qui se multiplie en même temps que les chromosomes. Pour obtenir de grandes quantités de ce plasmide celui-ci est tout d'abord introduit dans une bactérie - E.  [...] coli -(l'avantage d' E. coli est qu'elle se multiplie très rapidement). Généralement un antibiotique est utilisé pour ne permettre la croissance que des bactéries qui ont reçu le plasmide (le plasmide porte un gène de résistance à l'antibiotique). Ainsi, après une nuit de culture, on obtient assez de bactéries pour pouvoir extraire le plasmide pur en grande quantité.  [...]

PCR et vecteur de clonage

La bactérie pour se multiplier va répliquer son génome et le plasmide contenant le gène A. Au final tu obtients donc un plasmide d'expression, en grande quantité, et contenant le gène d'intérêt. Tu peux également récupérer la protéine A (synthètisée par la bactérie car codée par le gène A) dans ton milieu de culture.  [...] Donc il doit etre possible de calculer l'amplification en aprtant du postulat (faux) qu'une seule molecule transforme une bacterie. tu connais le nombre de plasmide par cellule, et le nombre de cellules dans une culture de 5ml alors cela te donne un nombre de molecules.  [...]

[Biologie Moléculaire] pb de mutagenèse dirigée

pourquoi le plasmide devrait être dénaturé il l'est lors de la PCR mais pas avant, normalement le kit marche sur de l'ADN double brin.  [...] mon problème est que je n'obtient pas de colonies avec mon plasmide recombiné, les témoins de mutagenèse et de transformation sont OK, j'ai bien des colonies bleues et blanches. mais les bactéries traitées avec mon plasmide ne poussent pas sur le milieu de culture LB+ampicilline quelque soit la quantité d'ADN ou de solution bactérienne étallée.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

J'avais eu le même probléme l'année derniére, en plus moi je faisais des litres de culture, je ne te raconte pas la galére. Pour moi c'était. BL21 Star(DE3), plasmide pGEX-2T avec fusion GST-toxine bactérienne, promoteur tac et induction á l'IPTG. Finalement la solution dans mon cas pour avoir une assez bonne quantité de protéines recombinantes, était d'induire á une DO tardive de 1.  [...] Persso la première chose que je ferais c'est transfo, selection, culture overnight et miniprep de plasmide. Après digestion par restriction et tu sort la GST ou ton insert. Et là t'es sur que la construction est bonne déjà ça me semble essentielle.  [...]

[Biochimie] Calcul d'une concentration en ADN

Pour la quantité de plasmide, vous avez la taille du plasmide. A partir de là, toujours en utilisant la masse molaire moyenne d'un dNTP et en vous rappelant que l'ADN est double brin, vous retrouvez la masse molaire du plasmide. Comme vous connaissez déjà la masse de plasmide dans l'échantillon, vous retrouvez le nombre de moles (la quantité) de plasmides dans l'échantillon.  [...] Comme on me demande la concentration je présume que je dois d'abord calculer la masse de plasmide ainsi que sa masse molaire, et en déduire la quantité de matière de plasmide, et diviser par le volume. Suis-je ok cette fois ci.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

J'ai prévu de refaire des tests avec des souches ne possédant pas de plasmide et de rajouter une quantité de plasmide en DNasant ou non les extractions.  [...] Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...]