• Santé - Quantité, ARN, Total

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Mais ma question est la suivante, après les résultats de Q-PCR, je trouve par exemple dans l'échantillon 1 le gène A exprimé 2 fois plus que l'autre, faut-il alors que je normalise par la quantité d'ARN total initiale ou cela n'est pas représentatif de l'expression.  [...] Donc en fait l'idéal serait que j'ai une idée du nombre de cellules présent dans mon échantillon pour pouvoir ramener ma quantité d'ARN total à un nombre de cellules pour vraiment voir ce phénomène de dilution.  [...]

[Biologie Moléculaire] qRT-PCR

J'ai extrait l'ARN total puis dosé par spectro. Mon problème est à l'étape de la RT. Mes concentrations sont d'environs 30µg/mL (dans un volume de 30µL d'eau). Sur tous les protocoles que j'ai pu voir, les RT sont effectués à partir de 1µg d'ARN dans un volume final de 20µL, je n'ai pas de tels quantité.  [...] Après moi non plus je ne quantifie pas mes ANDc je fais ma RT en meme temps pour tous mes échnatillons pour qu'ils soient traités de la meme facon et apres j'estime que la RT a été efficace de la meme facon pour tous et je ne résonne plus qu'en quantité d'ARN, bien sur la RT n'est pas efficace à 100 % mais on fait comme.  [...]

Normalisation RT-PCR quantitative

Personnellement, je n'aime pas trop la méthode du delta delta de Ct, car je trouve que ça induit un biais supplémentaire. En effet, rien ne te dit que l'expression de ton fameux gène de contrôle n'est pas un peu modifiée quand même par le traitement. Je préfère doser soigneusement mes ARN au spectro et faire toujours ma RT avec la même quantité d'ARN (5µg) et rapporter l'expression du gène à la quantité d'équivalent ARN totaux.  [...] Par contre, il faudra peut être que tu rapportes tes Ct à la quantité de RT (ou d'ARN total initial) dans certains cas. Car parfois, il faut diluer beaucoup pour avoir un Ct correct, c'est-à-dire non saturé et hors du bruit de fond. En gros, je gardais les Ct entre 20 et 35 (mais j'avais ma gamme d'ADNg pour me guider).  [...]

[Biologie Moléculaire] Encore de la Q-PCR : quantification absolue maintenant

Ma question aujourd'hui est la suivante. je souhaiterais faire une quantification absolue de mon transcrits d'intérêt pour cela j'ai compris qu'on utilisait la gamme de dilution et les Ct mais j'arrive pas à voir comment on peut revenir à une quantification de transcrits puisque pour la gamme on ne connait que la quantité total d'ARN et pas celle du transcrit.  [...] Mais je vois pas comment je peux connaitre dans ma gamme la quantité de mon transcript, je peux juste connaitre la quantité d'ARN tot.  [...]

[Biologie Moléculaire] Que devient l'ARNr dans une reaction de RT

Voila, nous avons effectué ensemble une extraction d'ARN total (à partir d'embryon de zebrafish) en utilisant un Kit (avectraitement à la DNAse). Pour vérifier la qualité des nos ARN nous en déposons 1µl sur une puce ARN Nano bioanalyser agilent. Nous y avons vu nos deux beaux pics d'ARNr 18 et 28S avec un RIN de 10.  [...] Effectivement, je n'ai pas utilisé de RNAse, ma transcriptase reverse a une petite activité RNase H (élimine les ARN des Hybrides ARN.ADN), j'utilise des oligo DT pour que ma RT soit spécifique des ARNm...alors dans mon tube de RT j'ai de l'ARN total, donc quand je depose moin cDNA sur puce, j'ai de L'ARNt, l'ARNr l'ARNm et du cDNA...alors ou sont passés mes ARNr.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR quantitative

Dans mon cas, j'utilise des dilutions au 10e, 30e et 90e. Ce qui revient à faire les quantif sur environ 50, 17 et 5 ng d'ARN totaux. Et là, en tenant compte de la dilution bien sur, j'obtiens 3 fois le même nombre de copies.  [...] Ceci dit j'arrivais à détecter des expressions très faibles avec mes PCR de 40 cycles (sur GeneAmp 5700). La plus faible a été 23 copies/ng ARN total.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN total sur fourmi unique

je cherche à extraire l'ARN total à partir d'une fourmi unique, dont je dois tirer 4-5 µg. J'utilise la méthode Trizol-chloroforme, mais j'ai toujours un problème de pureté, spécifique à la fourmi. J'ai un pic d'absorbance à 220-230 nm, dont je n'arrive pas à me débarrasser.  [...] De plus, le culot d'ARN est d'une couleur marron très foncé. J'ai essayé de purifié avec une colonne de kit, mais le problème ne s'améliore pas, alors que ça marche sur d'autres organismes. Je suppose que mon problème provient de la cuticule de la fourmi (je filtre mes échantillons sur colonne Qiashredder pour éliminer les gros débris avant la séparation de phase), et j'aimerais savoir si vous aviez des idées pour améliorer mon protocole.  [...]

Qcu

L adn chromosomal et l arn ribosomial 23s d'E.Coli ont comme poids moléculaire respectivement 2,2 109 et 1,1 106. Approximativement 0,3% de l Adn total sont hybrides avec cet Arn 23s. Donner le nombre de copies de gene de l Arn 23s que contient l adn d'E coli.  [...] 'ai pas compris. est ce que tt les copies de cet ARN vont se coller sur ube seule molecule d'ADN. dans ce cas ne serait pas insuffisant puisqu'il est si court.  [...]

électrophorèse

je suis d'accord avec la dernière réponse. je pense aussi que c'est dû au fait que les ARNm sont purifiés alors que les pistes 5,6,8,9 sont totaux donc peut être liés à des protéines. c'est juste une idée mais ce n'est pas sûr.  [...] Sur un extrait d'ARN total, les ARNr représentent 80% des ARN totaux. Par conséquent on ne voit qu'eux sur une électrophorèse. Les ARNm ne représente que 2% des ARN et passent inaperçus dans le gel. Tu devrais te référer à la réponse de sacharybalka qui me semble la plus juste.  [...]

[Biochimie] Influence de la concentration en enzyme Calcul activité spécifique

on calcule la quantité d'onpg hydrolysé dans le tube, volume total 3,3 mL.  [...] On peut tout de même considérer que l'enzyme non fonctionnelle est une impureté... Donc tout dépend de quel point de vue on se place. du point de vue de la protéine (sous toutes ses formes) ou du point de vue de l'enzyme fonctionnelle. Enfin c'était juste une parenthèse en passant.   [...]