• Santé - Quantité, ARN, Bactéries

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

L'idéal est de confirmer que tu as bien pris la même quantité d'ARN en quantifiiant aussi un gène de ménage (qui ne varie pas en fonction du traitement ou de la pathologie), et ce gène de ménage doit être au meme niveau dans tes 2 echantillons. Si ce n'est pas le cas, c'est que tu as.  [...] edit. vu la différence de quantité d'ARN, as tu fait un gel d'ARN pour vérifier l'intégrité des ARN dans l'échantillon le moins concentré Y a t il un traitement à la DNase pour t'assurer que tu n'amplifies pas le génomique qui aurait pu cntaminer l'échantillon le plus concentré D'ailleurs les amorces chevauchent elles des jonctions exon/exon, pour éviter d'amplifier l'ADN As tu un controle sans RT (donc pour lequel il n'y a pas de cDNA et qui théoriquement ne doit rien donner en qPCR ).  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN bactéries lactiques

Je cherche actuellement à extraire les ARN totaux de cellules de bactéries lactiques dans le but de faire de la RT-PCR quantitative (mesure de l'expression d'un gène dans différentes conditions).  [...] Je remonte brièvement ce fil à la surface pour donner quelques nouvelles. J'ai enfin réussi à extraire une quantité suffisante d'ARN de mes bactéries (voire même trop, je suis obligé de diluer ^^) en utilisant la méthode au tri-reagent (équivalent du trizol) et au phénol-chloroforme de Milohanic et al. modifiée.  [...]

[Microbiologie] l'ARN viral

Ensuite l'ARN polymérase traduite va se servir de l'ARN + comme matrice pour synthétiser de l'ARN - (non reconnu par les ribosomes). Cette ARN - va à son tour servir de matrice pour synthétiser de l'ARN + en grande quantité. Cet ARN + sera encapsidé et on aura donc des virions ARN +.  [...] Pour les ARN - ce cycle sera légèrement différent. L'ARN - n'est pas reconnu par les ribosomes, donc le virus va apporter son ARN polymérase ARN dépendante au moment de l'infection. Le brin d'ARN - servira de matrice pour synthétiser une grande quantité d'ARN +.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN pour puce

j'essaye d'extraire des ARN bactériens à partir d'un nombre restreint de cellules dans une solution qui contient pas mal de proteines. déjà c'est pas très simple d'avoir une quantité suffisante pour puce (10µg), et en plus je viens de les vérifier sur une puce agilent et je me rend compte que la plupart de mes arn extrait sont des 5s.  [...] tu essaies d'obtenir des mRNA je ne sais pas pourquoi tu as plutôt des 5S que des 18S ou autres (je me souviens jamais les différences entre procaryotes et eucaryotes...), mais de facon générale, dans toute extraction d'ARN, les ribosomiques sont en quantité écrasante par rapport aux autres ARN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Aide sur la qPCR

Euh, pour la quantité minimale d'ARN j'ai trouvé 3µg, mais je ne l'ai trouvé qu'une fois. Cette quantité vous paraît-elle raisonnable.  [...] Moi quand j'ai fait de la PCR en temps réel en M2 on partait de 1 µg d'ARN pour faire la transcription inverse. C'est largement suffisant vu que tu n'as besoin que de quelques ng d'ADNc pour la PCR.  [...]

Quantification d'ADNc après une reverse transcription

J'ai arrêté de normaliser avec un gène de ménage (ca n'a aucun sens à mon avis). En théorie, le fait de partir d'une quantité d'ARN constante est une normalisation suffisante.  [...] En tout cas pour les manips futures, je suis bien tenté d'appliquer la méthode de 5ng d'ARN initial par point. Mesurer la quantité de cDNA me parait plus introduire un biais supplémentaire qu'autre chose.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction ARN

Ce qui peut limiter l'extraction c'est. la quantité de matériel de départ, la qualité de la lyse cellulaire, la concentration relative en ARN.  [...] sinon faire un mélange avec methanol-chloroforme (récupérer la phase supérieur) suivi d'un mélange chloroforme (récuperer la phase supérieur) suivi d'une précipitation à l'acetate de sodium et ethanol (0.3M finaux d'acetate de Na, avec 2.5V de ethanol 99%, une heure a -20°, centrifuger récupérer le culot et le laver avec 250 microlitres ethanol 70%, centrifuger evacuer l'ethanol et resuspendre en eau-DEPC ) permet normalement d'avoir une bonne qualité d'ARN sans trop de pertes.  [...]

[Biochimie] Améliorer la quantité, qualité et pureté d'une extraction d'ARN

De façon générale, le matériel en colonne est plus propre notamment parce qu'on évite plus facilement les contaminations par carry over, par contre je suis étonné que vos ratios 18/28S ne soient pas meilleurs.   [...] Pour les deuxméthodes ont a utilisé des centrifugations à 13 000 rpm, surtout dans la méthode par colonne.Donc, est-ce que le nombre de centrifugations aurait un impact dans la dégradation de l'ARN puisque c'est dans la méthode par colonne où c'est plus visible et c'est dans ce méthode qu'on trouve le plus de dégradation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction de l'ARN+ RT-PCR

Je suis nouvelle dans le domaine de la biologie moléculaire. Je vais faire l'extraction de l'ARN à partir des biopsies et des cellules pour faire par la suite une RT-PCR. Je n'arrive pas a choisir le Kit d'extraction d'ARN et de la RT-PCR. En se basant sur votre expérience pouvez vous me recommender les kit qui me permettent d'extraire mon ARN (en bonne qualité) et pour faire ensuite RT-PCR.  [...] Je connais quelqu'un qui utilisait le kit de MP (ex-Qbiogen) Pro RNA avec la machine FastPrep, réputée pour sa grande efficacité dans la lyse des tissus les plus robustes, pour obtenir des ARN de cellules de poumons et autres tissus humains. Les ARN obtenus sont de bonne qualité (Confirmé par analyse Agilent) et en bonne concentration, les protocoles rapides (moins qu'une colonne par contre) et on peut faire des analyses transcriptionelles précises derrières.  [...]

Différents types de RT PCR

Avec la RTqPCR, tu vas détecter la pr ésence d'ARNm cibles dans une population d'ARN et tu vas déterminer ce qu'on apelle le cycle seuil (Ct). le Ct t'indique à quel moment tu obtient une quantité non négligeable (qui est en fait la projection sur l'axe du temps, du point au milieu de ta courbe d'apparition de ton ARN).  [...] Plus le Ct est faible et plus ça veut dire que tu obtient ta quantité critique d'ARN, rapidemement. Donc, si tu me suis, si tu as un ARN1 avec un Ct de 22 et un ARN2 avec un Ct de 27 par exemple, ça veut dire que l'ARN1 apparait avec seulement 22 cycles PCR alors qu'il en faut 27 pour obtenir la même quantité d'ARN2.  [...]