• Santé - Quantité, ADN, Protocole, Vecteur

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Je commence mon 1 er clonage, donc pour faire court j'ai coupé mon vecteur avec une enzyme de restriction ApaI, qui devrait le linéariser.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.  [...]

ADN recombinant et plasmide

Lorsqu'on fait une expérience de clonage comme celle que tu vois sur la diapo, le plasmide n'est pas retiré d'une bactérie. C'est un vecteur que l'on a en stock dans nos labos (et que l'on achète à des sociétés qui les produisent souvent) et qui permet d'insérer le fragment d'ADN qui nous intéresse pour le multiplier en grande quantité dans des bactéries (généralement des Escherichia coli ).  [...] Juste pour savoir si je ne me trompe pas où si j'ai totalement mal compris mon cours... on a bien de l'ADN plasmidique dans notre corps... quand je dis dans notre corps je parle des mitochondries.  [...]

[Biotechnologie] vecteur de clonage et vecteur d'expression

CA peut être plus ou moins similaire, a part que le vecteur de clonage est fait pour être réplicable en bactéries (comme une sorte de vecteur navette ou on insère ce que l'on veut pour l'amplifier, c'est a dire qu'il contient des origines de réplication, des sites de clonages, etc), tandis que le vecteur d'expression est lui équipé des éléments nécessaires a l'expression de ta séquence, que ce soit expression procaryote ou eucaryote.  [...] Un vecteur de clonage permet, comme son nom l'indique, de faire un clonage, c'est à dire de placer un insert dans le vecteur d'intérêt (ligation) puis après transfection/conjugaison/infection/... de multiplier la quantité d'ADN au cours des divisions bactériennes/des infections virales/... selon le type de vecteur utilisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

pour le protocole de clonage, la première étape est la création d'une banque d'adn (extraction adn, digestion par une enzyme de restriction puis ligation de ces fragments dans des plasmides portant les sites de restrictions de l'enzyme restriction choisie).  [...] On ne clone pas avec un plasmide mais dans un plasmide. Cloner, c'est le fait de reproduire à l'identique quelque chose. Un clone, c'est l'ensemble des éléments identiques (deux jumeaux forment un clone). Ainsi pour cloner de l'ADN, on l'insert dans un vecteur (dans votre cas un plasmide) et on amplifie la quantité de vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Le seul souci c'est que personne dans mon labo ne semble avoir de protocole pour ces manipulations. J'ai bien une idée des manips à faire, mais pour ce qui est des quantités à digérer et à ligaturer, de si je dois faire un gel ou non à chaque étape et tout et tout (sachant que mon insert est en faible concentration, moins de 7 ug/uL.  [...] Voilà, donc pour les infos. mon insert fait environ 700 pb, et je vais utiliser comme vecteur le plasmide pBluescript SK, et je sais quelles enzymes je vais utiliser. Si vous avez une idée de protocole, des quantités, des temps d'incubation et tout je suis preneuse.  [...]

Que ce qu une ligné d encapsidation?

Le vecteur proprement dit conserve les séquences cis régulatrices indispensables. les LTR pour le contrôle de la transcription et de l'intégration, y pour l'encapsidation et PBS (Primer-Binding Site) pour la réplication virale.  [...] La particule virale utilisée comme vecteur thérapeutique est aisément produite en grande quantité par une lignée productrice transcomplémentante ayant intégré dans des sites différents de ce génome, d'une part le virus helper et d'autre part le vecteur sous forme d'ADN proviral.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Après extraction de mes bandes d'ADN obtenu sur gel, j'ai réalisée une purification avec le kit nucléoSpin Extract II de Macherey Nagel. Ensuite j'ai vérifiée sur gel que je n'avais pas perdu trop en quantité d'ADN pour la ligation. J'ai donc effectué la ligation sur vecteur de clonage pGEMT-easy de Promega en laissant une nuit à 4°C puis T°ambiante.  [...] pour l'instant je vais refaire la ligation avec des volumes différents. Je pense que les bactéries DH5a E.coli n'est pas la source du problème. Se serai peut être la quantité d'ADN ou d'enzyme lors de la ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

(2) pour respecter mon ratio insert/vecteur molaire théorique (tout en restant dans un petit volume) je dois mettre beaucoup d'insert. cet excès d'ADN peut il inhiber la réaction de ligation 100 ng de matériel total cela vous semble une limite max à pas dépasser.  [...] Rapport vecteur.insert 1.10 ok mais tu utilises quelle quantité exactement d'ADN Et tu transformes avec quelle volume de ta ligation (pour quel volume de bactéries ).  [...]

transgenèse

coli par ex pour multiplier cette séquence d'adn qui nous intéresse. C'est l'étape nécessaire de multiplication de la construction génétique pour disposer d'une quantité suffisante d'adn à intégrer afin d'avoir des chances raisonnables de réussir la transgénèse proprement dite.  [...] En fait (après vérif.), le plasmide Ti utilisé comme vecteur de transformation est bien désarmé parce qu'on lui a enlevé les oncogènes responsables de la galle situés dans la partie qu'on appelle ADN-T (pour ADN de transfert car c'est cette partie qui est transférée dans l'adn de cellules végétales et qui provequera une tumeur).  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription in-vitro

Je me demandais pourquoi, lors d'une transcription in-vitro, on doit obligatoirement linéariser le vecteur contenant l'ADN d'intérêt. Par exemple j'ai cloné mon ADN dans le vecteur pSFV1 pour le transcrire in-vitro je dois linéariser le vecteur à l'aide de l'enzyme Spe1 dont le site est situé juste avant le promoteur SP6 nécessaire à la transcription.  [...] Normalement on linéarise un plasmide pour pouvoir mettre un terme à la transcription in vitro. Si on ne linéarise pas, la polymérase transcrit et ne s'arrête pas. Je trouve ça étonnant de linéariser pour aider la polymérase à transcrire. Un vecteur de clonage est constitué de deux promoteurs, un qui sera en amont de notre gène (ADNc) et l'autre en aval.  [...]