• Santé - Protocoles, Séquences, Amorces

[Génétique] RT-PCR, ADNc double brin

Je sais qu'on commence par extraire les ARNm de la cellule, et qu'on utilise une reverse transcriptase pour faire un ADNc complémentaire à l'aide d'une amorce poly(T).  [...] c'est en effet une amorce qui se trouve en 5' du gène d'interet. sinon dans certains protocoles on met des sequences adaptatrices pour pouvoir amplifier avec des amorces universelles.  [...]

Conditions experimentales PCR, test primers !

Mon travail consiste a tester des couples d'amorces (primers F/R) afin de determiner les conditions experiementales pour leur utilisation. J'ai testé ces amorces avec une temperature d'hybridation standard donnée par les differents protocoles de PCR. 55°(diferente de celle indiquée sur les etiquettes des tubes des amorces) et la plus part de mes couples d'amorces ne donne pas de signal ou de signal specifique.  [...] . toutes vos idées à propos de ce que je fais me seraient utiles. determiner les bonnes conditions experimentales pour l'utilisation de differentes couples d'amorces (primers), comment savoir la bonne temperature d'hybridation, comment savoir combien de cycles de PCR pour chaque amorce.  [...]

Transfection cellules Jurk 4

Je souhaiterai transfecter des cellules Jurk 4 avec différentes constructions dans le vecteur PXM139. Si possible par electroporation. Est-ce possible Si oui, quelqu'un pourrait-il me fournir un protocole.  [...] Si vous avez un électroporateur, normalement ils fournissent un liste de protocoles préinstalés dans la machine, ou alors des séquences électriques à respecter pour chaque lignée cellulaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Pcr

je dois chercher la délétion delta 32 au niveau du CCR5 chez les patients. je voudrais savoir comment réellement (je voudrais dire en pratique) choisir les amorces je sais que dans la littérature, on dit que ca dépend de de la tm, de la température d'anealing et aussi du nombre de pb.  [...] Vous avez fait des recherches pour voir si, dans la littérature, il n'y avais pas des publi ayant déjà traité le sujet. Bien souvent il existe des protocoles avec les amorces détaillées, ça simplifie déjà le travail.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation in situ

je suis en thèse et je dois réaliser une ISH or je n'en ai jamais fait de ma vie. j'ai récupéré des protocoles mais je voudrais savoir comment faire le design des amorces pour mon gène avec T3 et T7 HELPPPPPPPPP.  [...] Les amorces c'est pour designer la sonde que l'on va insérer dans un vecteur qu'il faudra ensuite linéariser par restriction selon l'orientation et transcrire (souvent avec la T3,la T7 ou la SP6 polymérase) pour obtenir de l'ARN.  [...]

probleme DGGE

Je suis actuellement en stage dans un laboratoire d'analyse du sol. J'ai pour but de faire migrer plusieurs échantillons de terre selon des conditions différentes à travers un gel DGGE.   [...] j'ai au préalable extrait l'ADN de mes échantillons grace à un kit commercialisé et fait pour l'analyse des sols, par la suite j'ai réalisé un produit PCR avec des amorces préalablement designé, j'ai également réalisé mon gel à gradient 45-65% d'acrylamide en suivant un protocoles pré-établi.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage vs PCR pour séquençage?

J'ai quelques difficultés à comprendre pourquoi dans un séquençage shotgun on utilise nécessairement un clonage des séquences, tandis que pour du pyroséquençage on peut simplement utiliser une PCR ce qui rend l'opération beaucoup plus rapide. Il doit y avoir une subtilité que je ne vois pas dans les protocoles, qui empêche d'utiliser une simple PCR pour du shotgun, mais je vois pas laquelle.  [...] Je ne vois pas de raisons théoriques si ce n'est que les sequençages à partir de PCR sont toujours moins beaux que ceux effectués à partir d'un clonage. Les amorces doivent avoir du mal à s'apparier sur le fragment PCR qui n'est pas surenrouler.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème génotypage souris mutées

Seulement depuis quelques temps je n'obtiens qu'une seule bande voir aucune. J'ai recommandé des amorces, j'ai changé de kit pour la PCR, j'ai testé différents protocoles de digestion des queues et ça n'a rien changé.  [...] Je ne comprends vraiment pas ce qui se passe, c'est arrivé d'un coup alors que je n'avais absolument rein changé à mon protocole, je me suis dis que ça pouvait venir des souris en elles-même (mutation au niveau de l'amorce) mais ça n'explique pas le fait que j'obtiens deux résultats différents pour un même échantillon.  [...]

rDNA ou rRNA?

La question reste pour le debut du protocole. il en existe certains (de protocoles) ou l'on fait l'extraction d'ARN, puis RT-PCR avec les amorces universelles, et d'autres ou on fait l'extraction d'ADN et PCR classique.  [...] Je veux bien en effet les séquences des amorces (en message privé peut être pour ne pas encombrer inutilement le forum). Par contre c'est étonnant que tu n'ais pas de références.Elles sont peut être propres à ton labo.  [...]

conseils en PCR

Est-ce que une PCR sur l'adn 16s est la plus adaptée pour ce genre de problématique comment choisir les amorces et les enzymes sachant que nos microorganismes ne sont pas caractérisés génétiquemment. Ou peut on trouver des protocoles. Quels sont les fournisseurs.  [...] Pour ce qui est des protocoles, appui toi sur les publis, et si tu ne comprends pas quelque chose, tu trouveras surement de l'aide ici.  [...]