• Santé - Protocole, Extraction, Nucléaire

[Biochimie] Protocole extraction des histones

J'ai une extraction nucléaire à faire demain, je voulais faire un extraction acide, mais je viens de me rendre compte que je ne n'ai pas de TCA à 100 %, mais du TCA à 20%.  [...] Au pire si je trouve pas d'autres protocoles, je vais essayer de faire 1.25V de TCA (x5 en fait) en jouant sur le volume V pour pas qu'il soient trop elevé pour pas trop diluer mes histones et j'augmenterais le temps de centrifugation... Qu'en pensez vous.  [...]

[Biochimie] Extraction d'une protéine nucléaire pour WB

J'ai d'abord commencer à faire une extraction au SDS (plus cocktail d'inihibiteur), j'ai aussi essayé tampon d'extraction classique (Triton, Glycerol, NaCl, EDTA, anti protéases). Apres dosage et dilution dans lameli, j'ai fait un WB (migration sur gel 10% SDS.  [...] Le probleme c'est que ma protéine est pas très exprimé et les anticorps ne sont pas de très bonne qualité (et les tampons d'extraction pas forcement les meilleurs), au final j'ai beaucoup de non spécifique, pas beaucoup de signal au niveau de ma bande.  [...]

[Biochimie] Fractionnement cellulaire

j'ai fait un Tp, il ya peu de temps sur le fractionnement cellulaire, et je ne comprend pas trop le faite d'avoir ajouté dans mon tampon HSB, du Nacl 0.35M avant la récupération de la fraction nucléaire.  [...] Je pense que c'est plutôt une question de pression osmotique. Pour les protocoles d'extraction nucléaire, au moment de récupérer le noyau les tampons sont bien plus riches en NaCl. Le noyau doit être un milieu plus concentré en solutés que le cytoplasme. Pour ne pas qu'il éclate, on se place à une concentration isotonique donc on augmente la concentration en sel...simple supposition.  [...]

[Biologie Cellulaire] Infos protocole

- les conditions d'IP dépendent de la protéine à immunoprécipiter. sa localisation (membranaire, cytosolique, nucléaire) conditionne le type d'extraction protéique à effectuer, de son abondance va dépendre la quantité de lysat à utiliser.  [...] la proteine est la nitric oxide synthase phosphorylée elle doit etre memnbranaire et peut etre cytosolique je l' extrai d'une tranche de cerveau de 250micrometre elle est donc en tres petite quantitée.   [...]

[Biochimie] Extraction proteine nucleaire nematode

Si c'est un facteur de transcription tu as différentes solution, soit tu fais un ChIP mais il te faut un anticorps contre ta protéine d'intérêt.   [...] Sinon tu peux taggé ta proteine mais ca va te prendre du temps, si tu as la séquence tu fais un histidine tag ou une fusion avec la gst et tu isole sur colonne d'affinité. Mais pour ca va falloir faire des constructions, les microinjecter, et avoir des vers transgéniques.   [...]

Protéines du noyau

Dans les livres, si jamais tu trouves des informations sur les phi (et je ne sais pas ou car ce n'est pas ma specialite...) les proteines vont probablement etre classees par familles, ou fonction mais probablement pas par localisation...en tous cas pas pour des proteines nucleaires.  [...] Ben si tu veux isoler spécifiquement les protéines nucléaires je pense qu'il te faut les isoler dés l'extraction protéique en faisant un extrait cytoplasmique et un extrait nucléaire.  [...]

[Biochimie] Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

Afin de montrer la localisation préférentielle d'une protéine (noyau / cyto) dans différentes conditions et avec différents mutant de cette protéine, je recherche un protocole permettant de séparer le cytoplasme de la fraction nucléaire. Puis, je visualiserai les niveaux de la protéines en WB.  [...] Je sais que cela se fait bien avec des kits notamment le kit Pierce Thermo NE-PER nuclear and cytoplasmic extract reagents. Mais ce genre de kit coûte très cher, ils se moquent de nous, il ne s'agit que de tampons. Je sais que ce type de manip peux de faire des protocole home made.  [...]

[Biologie Moléculaire] immunohistochimie sur rein de souris

Je dois faire une immunohistochimie sur des sections de rein de souris. J'utilise un protocole où je masque avec de l'eau oxygénée la péroxidase endogène puis je bout les sections dans du citrate de sodium pour réveler l'antigène. Je bloque avec de la BSA/PBS dans laquelle j'ai de la streptavidine puis le premier anticorps avec de la biotine dans la solution.  [...] En fait dans mon protocole c'est soit PBS triton soit citrate de sodium. Le problème c'est que le PBS triton ne peut pas être utilisé pour les protéines dans le noyau, ce que je veux détecter... Dans le cas de protéines nucléaire on utilise le citrate de sodium au microondes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transcription de l'ARNm, ... MAR ?!

2. à approcher certaines sequences de la matrice nucléaire, donc disons de donner une sorte d' architecture à la chromatine nucléaire. Hors certaines protéines, certains facteurs sont pr ésents dans un compartiment du noyau et pas dans l'autre. d'ou une possibilité encore de réguler la transcription.  [...] Les MAR, elles se situent pr ès de l'enveloppe nucléaire, donc elles vont permettre l'attachement de la chromatine à ce niveau là, et donc l'ARN pol qui va servir à la transcription va lui aussi se situer à ce niveau,non Alors comment est-ce possible que la transcription se fasse dans le nucléole, qui lui se situe au centre du noyau et non pas à proximité de la membrane nucléaire.  [...]

vocabulaire

En fait l'enveloppe nucléaire est une double couche phospholipidique. Il y a donc une membrane interne et une membrane externe. Ca c'est pour les descriptions classiques de cytologie mais compliquons encore la chose en disant qu'il existe dans cette membrane des pores qui permettent la communication entre le noyau et le cytoplasme.  [...] Sinon la composition proteique est peut être différentes mais il y a bel et bien continutié entre les deux membranes nucléaires (et le REG si on veut compliquer encore plus les choses).  [...]