• Santé - Protéines, Voltage, Séparation

[Biologie Moléculaire] Page sds

Voilà je voudrais savoir quel est le voltage adéquat pour séparer de protéines de 280 et 290 kDa, sachant que jusqu'à maintenant je n'ai pas pu le faire en utilisant des gel de 4-12% et 3-8% à 200V. Je sais qu'avec un SDS-PAGE la charge des protéines n'a pas de roles sur mobilité mais le voltage peut-il jouer un rôle sur la résolution de la séparation.  [...] Je profite de ce topic autour du page-sds pour vous demander un éclairage de ma lanterne s'il vous plaît. Nous avons évoqué cette technique de séparation des protéines selon leur masse dans le cadre de mon master 2, mais les protéines étant de composition en acides aminés différente, avec ce que ces derniers peuvent avoir de fonctions acides ou basiques différentes, je n'arrive pas à comprendre comme la charge globale d'une protéine dénaturée au page sds peut être la même entre deux protéines différentes.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Ce qui me semble bizarre c'est que les bandes ne sont pas tellement vilaines, c'est surtout que mes protéines donnent l'impression de rester bloquer au début du gel de séparation.  [...] J'utilise effectivement un stacking, en ne mettant qu'un voltage constant de 100V pour le stacking et le séparation. j'ai eu fait dans un ancien labo deux voltage différent, 60V pour le stacking, 100V pour le séparation, mais je ne sais pas si ça aurait une influence dans mon cas.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Tu peux aussi essayer de diminuer le voltage, sans augmenter le temps de transfert pour être sure que tes protéines de bas PM diffusent dans le tampon.  [...] Tu peux aussi essayer de diminuer le voltage, sans augmenter le temps de transfert pour être sure que tes protéines de bas PM ne diffusent pas dans le tampon.  [...]

[Evolution] Origine du neurone

Les neuronnes sont apparus avec les cnidaires (meduses, anemone de mer, coraux) donc avec les premiers diploblastiques (il ont deux feuillets. ectoderme et endoderme separe par une mesogelee acellulaire). Ils sont apparut il y a un bon bout de temps si on en juge les fossiles je crois que les cnidaires etaient present dans la faune d'Ediacara ca fait environ 650 million d'annee.   [...] C'est assez pénible pour tout expliquer Ce n'est pas un phénomène purement éléctrique. Il faut considérer les gradients chimiques, la perméabilité de la membrane, les protéines en jeux(canaux voltage dépendants) etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...] Je me demande si c'est possible que avec le Temps et le voltage que tu mets, tes protéines ne passeraient pas au travers de ta membrane pour se retrouver dans le tampons moux ( je sais plus le nom) en dessous de ta membrane.  [...]

[Biologie Moléculaire] Que devient l'ARNr dans une reaction de RT

Chaque puits contient un micro réseau dans lequel il y a le gel de séparation qui va être en contact avec une électrode, cette électrode sera soumise à un haut voltage qui va séparé tes ARN sur le Gel en fonction de leur taille. Quand les ARN passent dans le gels ils se lient au dye et à la fin du micro réseau la fluo sera detectée par la machine et tu vas obtenir un graphe avec les fluo et le temps de rétention sur le gel.  [...] De plus, j'ai fait un rapide calcul. vous dites que vous avez un volume final de 40 microlitre à la fin de la RT et que vous mettez 1 microgramme d'ARN. Si mon calcul est juste, cela vous donne une concentration de 25 nanogramme/microlitre. attention vous êtes à la limite de détection d'une puce ARN Nano.   [...]

[Biochimie] Western blot en pointillés

Avant je faisais un transfert identique à toi au niveau chimique (PVDF, méthanol sans SDS), 1 heure 30 à 400mA constant. J'avais les protéines de haut poids moléculaire qui se transférait mal vu avec les marqueurs de taille + PARP non clivé (110 kDa). Du coup je suis passé au même transfert mais d'une durée de 2h15-2h30.  [...] Tout se transfère très bien, sans augmentation notable de la température (avantage du transfert sans SDS), et les protéines de bas poids moléculaire (20 kDa), se transfère aussi bien. Tu peux donc essayer d'allonger le temps de transfert, voire de faire un faible voltage sur la nuit à 4°C.  [...]

[Biochimie] Sds page

De manière plus pratique, le voltage va déterminer la vitesse de la migration des protéines (et ions) dans le gel. L'ampérage lui indique la résistance électrique qu'impose le gel (et également la chauffe du matériel). Si il n'y a pas d'ampère détecter (ce qui ne veut pas dire qu'il n'y en a pas), le matériel n'est pas/peu conducteur.  [...] Donc pas de migration des protéines. Les ampères ne varient normalement pas beaucoup dans un gel (sauf si celui-ci présente des dépots solides de sels, qui s'assechent...). Bref, si au départ de la migration, les ampères sont normaux, et que à la fin de la migration, ils sont indétectables, c'est que le courant ne passe plus, ou a tellement ralenti qu'il ne fait plus migrer les protéines (ou très peu).  [...]

Integration du message nerveux et perte d'information

Donc plus cette constante sera grande plus il faudra une grande distance pour perdre la dépolarisation donc plus il y aura de chances qu'une dépolarisation issue d'une dendrite s'additionne à une dépolarisation issue d'une autre dendrite plus loin donc plus de chances de dépolariser suffisamment pour ouvrir les canaux Na+ voltage dépendants du début de l'axone, donc de déclencher des PA.  [...] Le neurone sensitif est souvent excitateur (pour transmettre l'information jusqu'au cerveau etc.) mais dans le cas de la théorie du gate control médullaire t'as le neurone sensitif de 1er ordre qui peut relarguer des endorphines, ces endorphines vont se lier aux récepteurs aux endorphines (mu, kappa, delta) couplés aux protéines Gi, par la suite la diminution d'activation de la PKA va induire une diminution de phosphorylation/activation des canaux calciques voltage dépendants présents sur le bouton présynaptique d'un autre neurone sensitif de 1er ordre.  [...]

[Biochimie] Paramètres western blot

J'ai déjà fait migrer une protéine de 220 kDa taggée eYFP ce qui élevé sa masse apparente à 250 kDa. Dans les conditions où j'avais la protéine endogène (220 kDa) et la protéine taggée (250 kDa), j'arrivais à séparer les deux formes d'à peine 1/2 cm (suffisant pour pouvoir les distinguer) sur gel 6% en faisant migrer à 80V dans le stacking, 120-130V dans le separating.  [...] L'important n'est pas le voltage pour séparer les deux bandes mais la distance de migration. Le voltage est surtout important pour la résolution des bandes. Je faisais arriver la bande de 60 kDa du marqueur de taille à 1 cm du bas du gel car j'avais une protéine à 60 kDa qui m'intéressait.  [...]