• Santé - Protéines, Quantité, Puits

Techniques utilisées en lab de biomol - Page 2

En fait, j'ai jamais bien compris l'utilité de cette expérience (Coomassie). Quand il manque des bandes dans certains puits, c'est nickel. Mais souvent on n'est pas très sur qu'elles manquent vraiment... Ou alors on n'est pas sur d'avoir la même quantité de protéines dans tous les puits.  [...] C'était pour détecter d'éventuelles différences dans les protéines du cerveau entre des souris mutante et WT. Effectivement, on a bien observé toute une région où les bandes étaient plus claires voire absentes (= une famille d'isoformes absents, finalement).  [...]

[Biologie Moléculaire] Dosage protéine

Je travaille sur des BL21 GFP et j'extraie les protéines totales par une simple lyse des bactéries dans deux situations. non induites et induites à l'IPTG. Avant de faire migrer sur polyacrylamide, j'aimerais doser mes protéines pour déposer la même quantité dans tous les puits.  [...] non, le sds et le triton (ainsi que la plupart des produits qu'on peut trouver dans un tampon d'extraction) n'interferent pas avec le bradford.   [...]

[Biologie Cellulaire] Extraction protéique pour western blot

Même si mon protocole est peut être trop long, il est néanmoins complet, et peut être fait en une 1/2 journée. Au moins, il pourra comprendre toutes les étapes, savoir ce qu'il y a dans le tampon, savoir combien il mets de protéines pour son gel... Bien sûr que c'est pas primordial pour juste vérifier si ta prot est bien là dans ton extrait, mais bon, j'imagine que si sa manip marche, il va devoir en faire d'autres, avec peut-être plusieurs boites, donc il faudra mettre une quantité équivalente pour chaque puits.  [...] Je disais juste ça parce que je me doute que la première fois que tu as fais une extraction prot à partir d'une boite, si tu n'avais pas dosé, tu allais mettre au pif une quantité de protéines. Avec un risque de charger trop (ou pas assez) ton puits.  [...]

[Biochimie] SDS page

aprés extraction des protéines. je n'arrive ppas à obtenir des bandes sur mon gel polyacrilamides. même si je précipite mes protéines avec l'acétone. il faut noter qu'il y à smire (trajectoir) sur mon gel. est ce que quelqu'un peut m'aider.  [...] C'est pas tellement le volume qui compte mais la quantité de protéine. Je trouve aussi que c'est trop de protéine pour avoir une belle migration.  [...]

[Biologie Moléculaire] les ARNs et extraction

Les échantillons sont déposés 2 fois mais à des quantité différente (les puits d'en haut contiennent moins de quantité d'ARN que les puits d'en bas). Je ne vois qu' un smear et dans tous les autres cas on ne distingue rien. Ceci est lié à une dégradation de l'ARN Peut-on dire qu'il y a contamination avec de l'ADN ou des protéines comment expliquer que dans un cas il y a un smear et que lorsque que l'on en dépose plus il n'y a rien merci de vos réponses.  [...] par contre l'histoire du smeaur est étonnante je ne dirais pas que l'ARN soit hors gel mais totalement dégradé (c'est vrai que c'est étonnant qu'il y ai un smear dans le haut du gel avec un quantité moindre). En fait pour moi ce qui est en rouge devrait être l'emplacemenent du 28 et 18S et en vert et bleu l'ARN dégradé das autres puits.  [...]

[Biochimie] Dilutions

Nous avons à disposition une protéine diluée 50 fois, ensuite nous mettons 0,5 ml de cette solution diluée avec 0,5 ml de milieu réactionnel (donc on dilue 2 fois).  [...] Tu ne dois pas prendre en compte la dernière dilution car ce n'en est pas vraiment une. L'activité que tu mesures dans ton puits résulte de la quantité de protéines présente. Peu importe le volume de KOH ajouté, la quantité restera la même. Le volume de KOH que tu ajoutes est juste là pour mettre en place la réaction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Migration SDS page en "sourire"

si tu as des puits en rab de chaque coté, dépose du tampon sans protéines (genre laemmli dilué comme si il y avait des protéines) dans chacun des puits libres de chaque coté. Idéalement, il faut centrer les dépots et combler les puits vides de chaque coté.  [...] 2) Si on laisse des puits inoccupés par un échantillon, les protéines des puits adjacents peuvent mal migrer, c''est ce qu'on appelle 'l'effet de bordure. Ce problème est facilement réglé en mettant simplement du tampon d'échantillon (1 X) dans ces puits inutilisés.  [...]

[Biotechnologie] Culture bactérienne et protéines recombinantes en plaque 96 puits

Je réalise déjà des tests d'expression de protéines recombinantes (sreening des meilleures conditions) mais en format tube...et ça prends beaucoup de place pour gérer la quantité d'échantillons. Habituellement, je réalise une étape de centrifugation à 15000g 30min 4°C en tubes, après la lyse bactérienne via un tampon de lyse commercial, pour séparer les fractions solubles/insolubles et analyser dans quelles fractions se trouvent la protéine produite (par SDS PAGE/WB/ELISA).  [...] Existe t-il un système permettant de séparer les fractions solubles/insolubles directement en plaque 96 puits. Est ce qu'il y a des utilisateurs qui ont l'habitude de faire de la production de protéines recombinantes en plaques.  [...]

[Génétique] Western blot

Je suis actuellement étudiante en Master 1 de génétique et je fais mon stage dans un labo de génétique et je fais beaucoup de Western Blot sur des lysats issus de lignées de liposarcomes. A chaque révélation des bandes, je constate que les bandes du contrôle que je met (la tubuline) ne sont pas identiques d'un puit à l'autre ce qui suggère que je n'ai pas déposé la même quantité de protéine dans chaque puit, mais pourtant je fais bien attention de bien déposer la même quantité de 20µl par puit (30µg de prot pour un QSP de 40µl avec du tampon de laemmli et du tampon de charge.  [...] Le dosage protéique a été effectué correctement. Je dois soumettre mes échantillons a différentes conditions (avec et sans inhibiteur) pour voir l'abondance d'expression des mes protéines selon la condition adéquate, donc il est impératif que la tubuline soit intacte pour tout mes puits pour que je puisse quantifier.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sds-page

C'est la réponse à ton exam les trois propositions là La 1 c'est pas possible vu que les protéines dans les puits 2 et 3 n'ont pas la même taille (à moins que c'était la même protéine qui c'est pas fixée et qui a été clivée après mais j'en doute). Les 2 et 3 ok même si c'est la 2 la plus plausible si la bande est vraiment intense.  [...] Et les protéines de différentes tailles dans le puits 2 ça doit être tout simplement des protéines cellulaires qui ne se sont pas fixées et qui sont virées avec le PBS.  [...]