• Santé - Protéine, Western, Bande

[Biologie Moléculaire] Comment savoir qu'un ARNm est entier ?

Un anticorps en western blot donne rarement qu'une seule bande, sauf si l'on dépose la protéine recombinante. Donc qu'as-tu déposé, des extraits (de tumeurs, de cellules surexprimant ta protéine après transfection d'une construction la codant,...), la protéine recombinante.  [...] Alors effectivement sur mon western j'ai fait migrer un extrait membranaire de rein et en parallèle un extrait membranaire d'une lignée cellulaire exprimant de façon endogène ma protéine. Les bandes surnuméraires que j'observe dans la lignée sont également présentes dans le rein. C'est effectivement peut être du non spé.  [...]

[Immunologie] immunoprécipitation

Dans la co immuno, tu va piocher avec un 1er anticorps ta 1ere protéine que tu soupçonne d'interagir avec une 2eme protéine. Ensuite a partir de ce complexe Anticorps/protéine que tu as purifié tu va essayer de detecter la 2eme protéine par un Western blot.  [...] Si tu a apparition d'une bande sur ton Western avec l'anticorps anti 2eme protéine c'est qu'elle est présente en meme temps que protéine 1, si pas de bande c'est que non.  [...]

[Biologie Cellulaire] Contrôler la pureté des protéines

Puis pour verifier la purete je ferais sur un gel d un cote une coloration au bleu de coomassie qui va colorer toute tes proteines et de l'autre un western blot avec des anticorps diriges contre la proteine que tu veux.. puis tu compare les 2 gels.  [...] Si c'est sur une purif oui mais pas sur des extraits. Une bande en western correspond à environ 30 ou 40 protéine différentes c'est pour ça qu'il est préférable de faire de la 2D avant de passer en spectro de masse par exemple.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

En gros, j'arrive a sortir une petite bande sur mon western-blot mais ça représente un fifrelin. J'ai essayé divers tampons de lyse mais j'évite tout de même avec détergent ionique car le but final est de mettre en évidence des partenaires de cette protéine.  [...] La protéine d'intérêt est-elle taggée L'anticorps utilisé pour l'IP est -il dirigé contre une étiquette Avez-vous essayé un WB sur le culot de billes après IP en procédant à une étape de dénaturation pour être sûr de dissocier la protéine des billes (parfois des anticorps se lie très fortement, dans ce cas il faut peut-être changer d'anticorps pour rester dans des conditions natives, ou alors tester avec des concentrations salines plus importantes).  [...]

lysat proteique

petite question du a une betise de ma part today. Je souhaiterai savoir si des lysats proteiques tiennent le choc a temperature ambiante. Aujourd hui j ai oublie toutes mes extractions proteique sur la paillasse ( y avait quand meme inhibiteur de protease) et donc je ne sais pas si mes echantillon seront bons pour un western.  [...] Si c'est juste verifier la presence d'une proteine et que le western donne une bande...pas de probleme, un premier blot donnera deja une indication.  [...]

[Biologie Cellulaire] ultracentrifugation et cellules!

je voudrais réaliser des ultracentrifugations différentielles afin de déterminer la localisation d'une protéine spécifique qui m'intéresse. mais au lieu de le faire sur tissu, j'aimerais le faire à partir de culture de HEK. Auriez vous une idée du nombre de cellules dont j'ai besoin pour avoir au final une quantité de proteine suffisante pour faire des western.  [...] Tout dépend du compartiment cellulaire que tu veux isoler, de la représentation de ta protéine dans ce compartiment...Donc c'est par l'expérience que tu sauras quelle quantité de cellule te permet d'avoir une bande convenable en western. Pour commencer tu peux essayer plusieurs conditions où tu auras mis un nombre croissant de cellules.  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

Le but de la methode est de recuperer quelque chose qui va etre associe a ta proteine (ligand, proteine, ADN etc...) le plus courant etant une autre proteine.  [...] 6. Tu déposes sur gel et fait un Western Blot. Tu révèles avec un anticorps dirigé contre ta protéine B (alors que l'IP a été faite avec un anticorps contre la protéine A). Si tu as une bande au poids attendu pour B, cela signifie que tu as co immunoprécipité B avec A.  [...]

[Biochimie] Casser des aggrégats

Est-il possible de casser ces aggrégats sans casser ma protéine Car ayant déjà fait l'expérience, il est impossibe d'avoir un bon signal en western blot avec cette protéine aggrégée.  [...] D'habitude, une fois le tampon de Laemmli ajouté, je dénature 1h à T° ambiante pour cette protéine. Et les résultats en western sont très satisfaisants, une belle bande.  [...]

Différence de fixation des cellules

Faut un peu se méfier de tout ce qui est immuno. Le résultat dépend grandement de la conformation de la protéine au moment où vous faites votre manip. En principe, les anticorps sont testés en western blot. Si il n'y a qu'une bande et de la taille attendue, c'est jugé comme bon et l'anticorps est déclaré spécifique.  [...] Le second point est que quand bien même vous auriez un résultat en histo ou en cyto, il n'est pas simple d'avoir un vrai contrôle. C'est bien beau d'avoir une jolie colo dans la bonne cellule. Mais est ce votre protéine Le vrai controle serait d'avoir une cellule mutante qui n'exprime pas la protéine du tout.  [...]

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Pourriez m'expliquer comment on fait pour normaliser une quantité de protéines lorsqu'on réalise un western blot, je sais qu'il faut utiliser des protéines comme la béta tubuline mais techniquement on fait comment.  [...] Même si le western n'est pas une méthode quantitative il est aussi possible de mesurer l'intensité de tes bandes avec un logiciel, et de normaliser ta prot d'interêt par rapport à ta protéine contrôle mais en général on se contente du visuel.  [...]