• Santé - Protéine, Fusion, Tag

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] De la, on peut dire que le GST est universel mais nécessite de faire une protéine de fusion, alors que l'IP on peut la faire en conditions physiologiques, mais il faut un anticorps spécifique qui fonctionne. etc.  [...]

La production des anticorps monoclonaux

De ce que j'ai pu comprendre, il y aurait injection dans le lapin d'une protéine de fusion { épitope -tag1} (le tag étant bien entendu une bien plus grosse protéine). L'ensemble des anticorps plasmatique seraient alors récupérés à partir du plasma de l'animal.  [...] La purification s'effectueraient en utilisant une seconde protéine de fusion { épitope -tag2} qui n'aurait que l'épitope en commun avec {épitope-tag1}.  [...]

Pourquoi utiliser le vecteur pH6EX3 pour faire du clonage moléculaire?

Dans une séance de laboratoire, on a utilisé le vecteur pH6EX3 pour y insérer un gène qui code pour la protéine BIP, pour transférer tout ça dans des bactéries E.coli. Je me demandais pourquoi on a utilisé ce verteur et pas un autre.  [...] peut être parce que ce plasmide permet de tagger l'insert avec un 6His. En fait cela permet de produire une protéine de fusion constituée de la séquence codée par l'insert et du tag 6xHis, tag qui peut être utilisé ensuite pour de la purification sur colonnes style NiNta, pratique pour avoir un peptide pur (ou presque).  [...]

Méthode de marquage - HaloTag

Si j'ai bien compris la brochure, en gros au lieu d'avoir une GFP comme protéine de fusion, c'est le Halo tag qui est couplé à la protéine d'intérêt. Le principe a l'air assez simple, en gros on peut ensuite coupler n'importe quoi sur le Halo (billes, biotine, fluorophore.  [...] ..). Ce qui fait qu'on peut l'utiliser pour localiser la protéines d'intérêt dans un tissu ou une cellule avec la fluo, mais aussi coupler avec des billes pour faire un réaction biochimique, ou encore fixer la protéine sur une lame de verre, le tout sans devoir recommencer le clonage à chaque nouvelle application.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

=. mon cadre de lecture est donc décalé et je ne vais donc pas pouvoir obtenir mon Tag qui m'aurait permis de detecter ma protéine de fusion suite à ma transfection.  [...] 4 nucléotides tu peux aussi les rajouter par mutagenèse dirigée, c'est rapide et efficace. En une nuit t'as muté, y a plus qu'à séquencer. Nous on le fait en routine et ça marche très bien.   [...]

[Biochimie] Extraction proteine nucleaire nematode

Si c'est un facteur de transcription tu as différentes solution, soit tu fais un ChIP mais il te faut un anticorps contre ta protéine d'intérêt.  [...] Sinon tu peux taggé ta proteine mais ca va te prendre du temps, si tu as la séquence tu fais un histidine tag ou une fusion avec la gst et tu isole sur colonne d'affinité. Mais pour ca va falloir faire des constructions, les microinjecter, et avoir des vers transgéniques.  [...]

[Biochimie] Séquence Kozak

Je vais donc en mettre une aussi devant la séquence codant pour le tag.Ma question. est-ce qu'il faut supprimer la séquence Kozak devant l'atg de la protéine pour ne plus avoir que celui en tête du tag ou cela n'a-t-il pas d'importance.  [...] D'un point de vue moléculaire, que se passe-t-il quand on une séquence Kozak devant chaque atg quid de la protéine fusion du tag.  [...]

[Biotechnologie] purification d'une protéine

Je ne suis pas du tout experte en purification de protéines mais en lisant les différentes étapes de la manip je me dis qu'en insérant la séquence codante pour la ligase dans E. coli, ils ont peut être en même temps créé une protéine de fusion avec une étiquette (par exemple GST ou Tag) et ont pu ensuite purifier cette protéine de fusion sur une colonne d'affinité.  [...] Tu fais une première purification et tu sors ta protéine plus des protéines aspécifiques. En coupant tu détaches de ta colonne uniquement ta protéine (ou presque), et tu repurifies après. Au final la deuxième purif donne une protéine plus pure que la première (moins de bandes parasites).  [...]

Traduction de termes anglais issus d'un article.

FLAG c'est une étiquette protéique qu'on ajoute aux protéines (protéine de fusion) justement pour faciliter sa détection, ou sa précipitation (avec un anticorps anti flag).  [...] si c'est ca. En fait il existe des vecteurs ou le tag (flag, 6his, myc, ou autre) est déjà là, en amont ou aval du site de clonage, du coup en intégrant ton cDNA en phase dans ce vecteur tu peux directement produire une protéine de fusion. Pratique.  [...]

[Biochimie] Dégradation tag et protéase

Le but de cette partie du projet, c'est d'avoir une activité protéase sur demande dans un organisme. Je pensais faire une protéine de fusion avec une partie de la protéase fusionnée au phytochrome, et l'autre partie fusionnée à PIF3, une protéine qui se fixe au phytochrome une fois activé par la lumière rouge.  [...] Le truc c'est que les Clp sont multimériques, et ça casse un peu le truc en rendant tout de suite les choses plus complexes, mais du coups je me demande s'il est possible de faire une protéine fusion avec ssbP coupée en deux et d'utiliser des tag ssrA mutés qui en gros ne peuvent pas être reconnu sans ssbP (c'est ce qu'ils ont fait dans ton lien je crois).  [...]