• Santé - Promoteur, Vecteur, Cellules

[Biologie Moléculaire] Utilisation d'un promoteur spécifique

Donc voilà j'aurai voulu savoir s'il est possible de créer un vecteur d'expression pour un gène (ou un si RNA) sous le controle spécifique d'un promoteur d'un autre gène ou si on peut d'une facon ou d'une autre faire en sorte qu'un vecteur ne s'exprime que dans des cellules bien particulières.  [...] Bien sûr, mais il faut que tu sois sûr de ton promoteur, que tu construises ton vecteur avec l'ensemble du promoteur en question. or les promoteurs sont parfois énorme chez les eucaryotes, et que tes cellules possèdent tout ce qu'il faut pour que ce promoteur soit actif.  [...]

[Biotechnologie] RNA interference : siRNA, shRNA

- Dans le cas des shRNA, la séquence codant pour le shRNA est contenu dans un vecteur, comment le vecteur est-il intégré dans l'animal A-t-on une insertion dans le génome (dans ce cas il serait possible de faire un genre de Knock-in), ou le plasmid reste-t-il simplement dans le nucleus, et exprime le shRNA (possibilité de passage à la cellule fille ).  [...] En effet le shRNA a besoin d'un promoteur et d'autres séquences pour s'exprimer (moins ready to use que le si). On peut effectivement l'intégrer dans un vecteur adénoviral (qui ne s'intègre pas. effet transitoire) ou lentiviral (qui s'intègre, donc effet stable si on utilise une sélection des cellules ayant intégré le vecteur) ou AAV.  [...]

[Biotechnologie] Fabrication d'une protéine d'intérêt ?

Il manque une étape entre la production du cDNA et la transfection dans les cellules. Le cDNA est inséré dans un vecteur d'expression qui contient outre les éléments classiques d'un vecteur (Ori, MCS, marqueur de sélection) un promoteur de transcription ainsi qu'un RBS (ribosome binding site) qui va permettre la traduction du transcrit.  [...] Ensuite vous faites votre transfection de bactéries ou de cellules eucaryotes. A noter que pour les cellules eucaryotes il existe deux types de transfection, stable (le vecteur s'insère dans le génome de la cellule) ou transitoire (le vecteur reste séparé du génome et finira par être éliminé).  [...]

Mammalian Expression Vectors

Donc, si t'as la possibilité, essaye peut-être un vecteur avec promoteur inductible, pour ne pas trop destabiliser tes cellules.  [...] Remarque dans le sens de la question de J Luc. Il me semble que la cycline E intervient dans la régulation du cycle cellulaire... Donc l'exprimer (en plus sous le contrôle d'un promoteur fort) est pour moi assez difficile, je pense que les cellules qui vont exprimer cette prot vont être complètement dérégulées, ou il y aura une modification de l'expression de ta prot exogène pour minimiser son effet néfaste et tu ne sélectionneras que des clones qui l'exprimeront peu ou pas du tout.  [...]

vecteur d'expression

Il existe des cellules qui ont été modifié pour les rendre permissive pour SV40(ex. HEK293T)... mais si tu veux exprimer ton gène il faut les transfecter avec un vecteur contenant un promoteur SV40.  [...] Le vecteur d'expression comprend la partie codant de ton gène, ainsi que des séquence non codante. promoteur, origine de réplication, polylinker... et souvent des gènes de résistances (ampiciline, neomycine...) ou des tag.  [...]

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...] De manière général tout est inclut dans le vecteur. promoteur, terminateur, eventuels tag et MCS (sites de restriction) Il ne reste qu'à cloner l'ORF du gène qui vous interesse. Que vous aurez extrait avec des enzymes de restrictions et en parallèles vous ouvrirez le vecteur à l'aide des mêmes enzymes de restriction au niveau du MCS afin de générer des extrémitée compatible.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Un gene eucaryote (avec son promoteur naturel) cloné dans un vecteur bactérien sera t'il exprimé dans une cellule humaine.  [...] Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.  [...]

levure s. POMBE

la molécule d'ADN composite obtenue (vecteur + gène d'intérêt) est ensuite introduite dans une cellule hôte(levure S. Pombe PK90b), qui exécute les instructions qui lui sont fournies par le gène d'intérêt, et réalise les modifications post-traductionnelles dans l'objectif de fabriquer la protéine recherchée(l'hormone peptidique ).  [...] Après tout ça je dois essayer insérer la bonne séquence dans un plasmide (Vecteur) et n'oublie pas la procéder par une bonne promoteur. Puis les méthodes de transfection nous aideront à introduire le gène dans la cellule méchante.  [...]

clonage insert

L'insert de 2825 pb est cloné dans un vecteur sous le contrôle d'un promoteur phagique Psp6. Après linéarisation du vecteur recombinant, celui ci est incubé en présence de l'ARN polymérase Psp6 et des 4XTP.  [...] Le vecteur recombinant est linéarisé puis incubé avec une ARNpol reconnaissant le promoteur Psp6 qui se trouve également sur ton vecteur et si tu met ça avec des DNTPs j'imagine qu'il se passe une reverse transcription.  [...]

[Biologie Cellulaire] A quoi sert le co-transfert avec un vecteur de résistance à un antibiotique

Il arrive que le vecteur contenant l'ADNc (dans ton cas l'ADNc (pas ARNc, les vecteurs sont a ADN en majorité (sauf certains vecteurs viraux)) codant les recepteurs de ta cellule, sous le controle d'un promoteur fort, permettant une forte synthèse de l'ARNm correspondant) pour le gène d'intérêt ne comporte pas de gène de resistance à des antibio eucaryotes.  [...] Pourquoi ne pas faire un stable qu'avec le vecteur codant les recepteurs et cultiver en dilution limite pour établir des clones à partir de cellules isolées sachant que la proba d'intégration est de moins de 1 sur 1 million, ce serait impossible de trouver rapidement un clone stable.  [...]