• Santé - Précipitation, éthanol, Lavages

Extraction ADN phenol : température de centri

Mais si quelqu'un pouvais m'éclairer sur le rôle de la température (par exemple sur la séparation d'avec les protéines, mais aussi l'extraction préférentielle de l'ADN vs ARN peut-être) ce serai super.   [...] ps. je fais homogénéisation dans du TE - lyse enzymatique (prot K-SDS) puis mécanique avec phénol/chlo pH8- un second phénol/chlo puis un chloroforme -RNase- précipitation à l'éthanol absolu - lavages -resuspension dans l'eau.  [...]

[Biologie Moléculaire] Micro ARN

J'ai déjà travaillé sur du plasma en voulant extraire l'ARNt circulant avec du Trizol invitrogen et mes rapports de DO à 280 et sutout 230 n'étaient pas fameux. J'ai même utilisé plusieurs méthodes (TRizol + KIT, TRizol + précipitation, avec des lavages supplémentaires et l'utilisation de différents carreers) c'était pas encore ça.  [...] -20°C. D'autre part, je lavais ensuite avec de l'éthanol 75° et non 70. Enfin je laissais sécher 15-30 min mais pas plus par peur de mal redissoudre le culot. Je pense refaire des essais en changeant ces petites choses. Je crois également que sur du tissu, les rendements sont meilleurs que sur du plasma.  [...]

[Biochimie] Précipitation des protéines.

Oui ça marche très bien. précipitation dans 4 à 5 volumes d'acétone (minimum 20 min à -20°C), centrifugation pour récupérer les protéines (15000g pendant 10 min) + 2 ou 3 lavages.  [...] Il y'a aussi la précipitation au phénol, PCA (acide perchlorique), le sulfate de zinc ou au tungstate de sodium et la précipitation thermique, mais pour le PCA et le sulfate de zinc et au tungstate de sodium sont dangereux car l'un est explosif(PCA) et le sulfate de zinc qui est une technique un peu complexe, particulièrement si on utilise le Ba(OH) 2 qui doit être conservé à l'abri de l'air.  [...]

[Génétique] Principe de l'extraction d'ARN???

Les acides nucléiques sont adsorbés sur la colonne. L'éthanol 70%permet de faire précipiter les AN tout en procurant assez d'eau pour dissoudre les sels des tampons qui eux neutralisent les charges des AN.  [...] L'ADN et les prot résiduelles sont éliminées par les lavages (RW1 et RPE). L'éthanol du tampon permet aussi d'éluer selectivement l'ADN afin de n'obtenir que l'ARN au final.  [...]

extraction phénol chloroforme

Je rejoins cette avis. Il est clair que les kit sont un gain de temps non négligeable. Après, tout dépend de l'utilisation qu'on veut faire de son ADN. En terme de rendement rien ne vaut la méthode a l'ancienne.   [...] L'extraction phenol/chloroforme (ou old school ) ne permet pas à elle seule de faire une extraction d'ADN. Il faut faire une lyse des cellules (lyse alcaline ou pk ou...) et d'autres étapes d'extraction/purification/précipitation/lavages peuvent être ajoutées.  [...]

[Biologie Moléculaire] un protocole fiable pou extraire l'ADN

je fais des extraction d'ADN à partir de sang humain atteint par le VIH,j'ai pas réussi a avoir un protocole convenable surtout pour la lyse des globules blancs.j'aimerais bien avoir une technique convenable et surtout fiable parce que mes ADN sont fragmentés et de mauvaise qualité(avec le détail des quantités de chaque réactif dans chaque solution ou bien simplement avoir la gentillesse de m'envoyer des sites ou des liens qui peuvent m'aider)merci infiniment.   [...] sinon je commence normalement par la lyse des globules rouges plusieurs lavages( solution.Tris,MgCl2,NaCl)et puis celle des blancs par (Tris HCl,EDTA,Nacl, et SDS..proteinase K...aprés éthanol absolu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Nettoyage d'ARNs & Transfert de protéines

1) J'ai des ARNs que je voudrait nettoyer. La DO 260/280 est bonne (. 2) mais je suis apparemment contaminé par les sels du tampon RLT (extraction sur colonne) puisque ma DO 260/230 n'est que de 1,3. Est-ce que vous pensez que ça peut poser un problème pour les envoyer en Q-RT-PCR Et si oui, pour éliminer ces sels, est-ce qu'une simple précipitation à l'isopropanol (+lavages à l'EtOH) suffirait.  [...] Concernant la précipitation tu as raison, c'est hyper dur à redissoudre. Je le fais dans du tampon 2D (saturé en urée, thiourée + CHAPS et SDS) et j'incube mes échantillons 1 nuit à 4°C (pas de congélation). Ca facilite la dissolution (le culot devient translucide, un peu gélatineux).  [...]

[Biochimie] Différence entre tween, triton x, NP ... ?

En général pour les lavages il est préférable d'en fait plus que pas assez. Si tu veux réduire les temps de lavage tu peux essayer de les multiplier. Plutot par exemple de faire 3x 20 minutes tu peux tenter de faire 4 ou x 10 minutes. Dans pratiquement tous les cas tu peux faire un premier lavage rapide (quelques secondes).  [...] Merci beaucoup de m'avoir éclairé sur les lavages. Je vais tester ces quelques manips dès maintenant. En fait j'utilise généralement de la BSA pour bloquer avec des lavages au PBS tween 20 0.1%. Je vais donc essayer les autres combinaisons buffer/detergent et changer les temps de lavages et nombres.  [...]

[Immunologie] Problème ELISA direct avec les puits non coatés

Je suis étudiant en stage en immunologie à l'IPL. L'objectif de ce stage est la mise en place de la détection et des dosages d'anticorps spécifiques à des composants salivaires d'anophèles (des peptides, plus précisément) dans une population humaine à forte pression anophélienne.   [...] 5. J'effectue 5 lavages puis je dépose la streptavide biotine peroxidase diluée également dans du PBS tween 1%. Incubation. 1h à 37°C.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

Sinon quelques suggestions. 10 lavages ça me parait beaucoup. Moi j'en fais 4 de 10 min, à force de lavages tu risques de diminuer ton signal plus que de l'améliorer. Après quelques membranes assez moches en nitrocellulose, je suis passée depuis bien longtemps au PVDF et perso je préfère j'ai de beaucoup plus jolis blots.  [...] Le méthanol a une meilleure mouillabilité que l'éthanol qui est plus sec. Effectivement on peut remplacer le méthanol par l'éthanol mais j'ai pu observer un transfert moins efficace avec l'éthanol, dans mes conditions.  [...]